成功进行双酶切实验之实战手册
如何保证2天获得正确的克隆?基本操作步骤:Day1:·A:PCR--电泳回收--酶切(1-2小时)--PCR快纯试剂盒回收;·B:载体DNA的酶切(1-2小时)--?如有需要,进行电泳回收。·注:A和B可同步进行节省时间,然后进行连接(设置载体自连对照),室温0.5-1小时,转化Day2:·观察过夜培养的平板上的克隆数:当目的连接板上的克隆数较较对照连接平板上的克隆数多3倍以上时,·可以直接随机挑选2-3个克隆进行测序分析。·注:基本不用 ...
来源:金弗康 29103 阅读
【交流】Gateway的原理
Gateway也可以被视为一种克隆操作平台:把目的基因克隆到入门载体(Entry Vector)后,就不用依赖限制性内切酶,而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶,高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体(Destination Vector,目的载体)上。Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子(INF、Int)的作用下,lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的 ...
来源:丁香园论坛 24990 阅读
真核基因表达载体的构建
提高目的基因在哺乳动物细胞中表达的策略:1、DNA水平:增加基因拷贝数(1)高拷贝载体;(2)基因共扩增;2、转录水平:利用强启动子、增强子,可诱导启动子,如CMV、Tet;3、翻译水平:优化翻译起始序列和非编码区序列。
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重组质粒的连接、转化及筛选
第一节 概 述 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆 较小的DNA 片段(<10kb)且结构简单质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆 从原理上说是很简单的,先用限制性内切酶切割质粒DNA 和目的DNA 片段 然后体外使两者相连接 再用所得到重组质粒转化细菌即可完成。但在实际工作中 如何区分插入有外源DNA 的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中 ...
来源:互联网 17007 阅读