关键词: 基因敲除 克隆筛选
来源: 江苏吉锐
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近年来,ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等基因组编辑技术可谓是层出不穷,尤其是CRISPR/Cas9,一出现便在全球范围内掀起一股热潮。同时,各大公司也开发出一系列相应的产品,其中一种至关重要的就是基因敲除阳性克隆筛选的试剂。 目前用的比较多的有CEL I酶,CEL I是植物来源的一种特异性识别碱基错配的酶,活性高,不会产生假阳性。
而且CEL I酶是目前生物界发现的唯一能准确切割异源双链DNA中存在错配位点的酶,在遗传学研究和应用领域中扮演重要的角色,多应用在临床诊断领域。如今市面上只有Cruiser™和Surveyor两个品牌。因为Cruiser™价格合适,且相比于进口代理产品拥有货期短的优点(国内可以2-3天内到货),做到真正质优价廉。
据了解,另一种被广泛应用于基因敲除筛选的X酶,其最早并不是为了做基因敲除筛选而生产的。它除了识别错配外,还可以识别十字型结构 DNA、Holliday 结构或交叉 DNA、异源双链 DNA,正是因为这个特点,很容易导致假阳性的现象。
图1. Holliday交叉(Holliday junction),无错配结构
近日,Cruiser™与市面上易出现假阳性的X错配酶,进行比较,实验结果见下:
下图为3T3细胞FADD基因敲除,已知在3T3细胞中FADD基因的敲除效率很低(其敲除pool测序无双峰),挑24个单克隆后经X酶切结果显示如图2,而经Cruiser™酶切结果显示如图3
图2 3T3细胞FADD基因X酶检测电泳图
图3 3T3细胞FADD基因Cruiser™检测电泳图
P1—Cruiser™酶切阳性对照 P2—X酶切阳性对照
结论:如上图结果显示,X酶的假阳性率达90%以上(图2中clone7与22除外),而Cruiser™的酶切结果,与敲除pool测序无双峰的结果相符合。
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