关键词: In-Fusion cloning
来源: 丁香园论坛
4558 阅读
使用Clontech公司的In-Fusion PCR Cloning Kit快两年了,在此谈谈心得。早期的In-Fusion PCR Cloning Kit是干粉,现在已经发展成为试剂盒,两种我都用过。此方法最大的优点就是不用考虑插入片段的正反性,只要链接成功就是阳性克隆。但是有时候链接效率低,比较不容易得到阳性克隆,因为我没有使用同类的其他链接方法,所以也不知道两者比较起来如何,但是据我的老师说这个方法效率高。在整个过程中,我觉得应该注意的有以下几点:
1 载体的酶切效率。此法需要使用两种内切酶,为了考虑后期实验的方便性,通常会选择一个酶切效率高的酶比如说BamH1 EcoR1,另一个效率相对较低的,比如说Not 1, Kpn1。这四种我都用过,如果buffer不一样的,可以先切效率低的再切效率高的,中间切胶纯化。
当然酶切效率跟载体本身结构也有关系,我用过的载体有pGBKT7,pGADT7,pEF4VH,pSeqTaq,Prolabel,pAcGFP,pTRE。其中pTRE没有成功过。
2 插入片段的处理 使用高保真的酶扩增插入片段,我用过TaKaRa的primesSTAR GXL DNA Polymerase另一种是Clontech的Advantage HD Polymerase。一般都进行切胶回收,用得QIAGEN的kit。Clontech公司在换新的Kit时曾经赠送过一种胶回收纯化试剂盒NucleoSpin Extract,个人感觉这个效率比QIAGEN的高,而且后期不需要酒精PPT纯化。
3 载体和插入片段的纯度,如果第一次没有成功,可以对插入片段使用酒精沉淀进行纯化,通常纯化过后就可以得到阳性克隆。Prolabel,pAcGFP这两个载体是试剂盒配的,链接效率相当高,其他的都是自己扩增的,效率相对低很多。
4 载体和插入片段的比率 可能和不同的载体,以及插入片段的长度有关,说明书有相应的建议比率,个人认为1kb以下的片段链接效率比较高,2kb以上的就比较低了,当出现链接不成功的情况,就可以提高插入片段的量,比如说2:1的提高到3:1。
5 感受态细胞 使用高感受态细胞,高感受态的DH5,我使用的是新鲜准备的XL1-BLUE cells。为了获得更多的阳性克隆,通常会使用两个培养皿,几乎全部的感受态细胞。
更有优质直播、研选好物、福利活动等你来!
小树洞:你们工作后第一个月都得了多少工资呢?
妇产专硕18年刚毕业,四证合一。找了个市级三甲医院,合同的。工作一个月,当时发工资,968元。之前应聘的时候说前三月试用期1300 元。试用期过后加奖金,没想到,呵呵,租房一月1000元。今天直接崩溃。打算明天打电话问财务扣的都是什么钱,了解清楚后闪人。回家继承祖业—烤地瓜,烤玉米走起。你们工作后第一个月都得多少工资呢?
16 评论
抗体保存
用奶粉或者BSA配好的一抗/二抗可以在—20度保存多久?大约几个星期还是一两个月?
7 评论
DNA提取有杂带
PCR产物用试剂盒回收的时候,发现有杂带?有哪些办法可以提取得更干净?
5 评论
本网站所有注明“来源:丁香园”的文字、图片和音视频资料,版权均属于丁香园所有,非经授权,任何媒体、网站或个人不得转载,授权转载时须注明“来源:丁香园”。本网所有转载文章系出于传递更多信息之目的,且明确注明来源和作者,不希望被转载的媒体或个人可与我们联系,我们将立即进行删除处理。
我的询价
询价列表
暂时没有已询价产品
手机验证
科研好物关注研选号