关键词: Southern杂交 分析方法
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预杂交液的制备:根据要杂交的膜的数量配制预杂交液,每25 ml预杂交液(1~2张膜)的成分组成如下:
1、取适量小麦基因组DNA,用适量的限制性内切酶消化完全(约5 U/mg DNA,酶切12 h左右),取少量电泳检测酶切完全性;然后依次用酚:氯仿和氯仿:异戊醇抽提,乙醇沉淀。而后溶解在20 ml TE Buffer中;
2、在1%的琼脂糖凝胶上电泳10~12 h,电压为3 V/cm;
3、电泳完毕后,将胶转入EB染色液中,染色10 min,紫外灯下检测酶切结果;
4、将胶转入500 ml 0.25N的HCl中,脱嘌呤15~30 min,直至溴酚蓝变黄,用水洗一下;
5、0.4 N的NaOH处理20 min。与此同时,尼龙膜在超纯水中润湿后,在0.4 N的NaOH中泡5 min以上;
6、将凝胶翻转后放在滤纸桥上,放上一张与凝胶大小相当的尼龙膜(Hybond-N+,Amarsharm),赶除气泡,在膜上放3层滤纸,与尼龙膜大小相同,赶除气泡,将凝胶周围用胶片封好,放上大小相当的吸水纸,压上约500 g的重物,转膜10 h以上,其间更换吸水纸;
7、标记点样孔一角,然后放在2×SSC中浸泡10 min,并进行轻微震荡。用滤纸吸干,保鲜膜包好,置4 ℃存放备用;
8、利用HYBAID固相杂交仪进行预杂交、杂交。杂交瓶中根据膜面积大小,加入10~20 ml预杂交液,预热到65 ℃,然后放入尼龙膜。65 ℃,预杂交5~6 h;
9、采用Takara公司Random primer DNA labeling kit进行探针标记,取适量待标记的DNA片段和Random primer 2 ml,加入ddH2O至终体积14 ml,95 ℃变性3 min后立即冰浴5 min,瞬时离心。然后在此管中,依次加入:
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小树洞:你们工作后第一个月都得了多少工资呢?
妇产专硕18年刚毕业,四证合一。找了个市级三甲医院,合同的。工作一个月,当时发工资,968元。之前应聘的时候说前三月试用期1300 元。试用期过后加奖金,没想到,呵呵,租房一月1000元。今天直接崩溃。打算明天打电话问财务扣的都是什么钱,了解清楚后闪人。回家继承祖业—烤地瓜,烤玉米走起。你们工作后第一个月都得多少工资呢?
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