关键词: CRISPR 基因编辑
来源: GeneCopoeia
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近年来,CRISPR技术掀起了基因组编辑的热潮。短短一年间,CRISPR技术已登上了数个知名榜单,包括Science的十大科学突破,Nature Methods的值得关注技术,以及Technology Review的十大突破技术。利用CRISPR技术发表的文章更是层出不穷。今天就和大家分享下CRISPR实验的主要步骤及需要考虑的因素。第一步,你要确定你做CRISPR的目的,即选一个CRISPR系统你要考虑清楚为什么要使用CRISPR系统,是破坏目的基因,还是编辑或修饰目的基因?不同的目的需要通过不同的修复途径来实现。两者的区别主要在于是否引入了包含外源DNA的修复模板。若只是破坏目的基因,Cas9在基因组DNA上产生的双链断链(DSB)通过非同源末端连接(NHEJ)途径进行修复。这个过程会在DSB位点随机插入或删除几个核苷酸,从而带来插入缺失(Indel)。Indel可能改变目的基因的开放阅读框,从而改变DSB下游的氨基酸序列;也可能会引入提前终止密码子,从而破坏目的基因。由于Indel是随机的,因此需要通过实验来确定基因破坏的类型和程度。若是编辑或修饰目的基因,则一般利用同源修复(HR)。当合适的模板存在时,HR能在Cas9诱导的DSB上引入特定的核苷酸修饰。同样,这个修饰也必须通过实验来证实。第二步,设计gRNA在基因组DNA中选择适当的目标序列,这对实验设计来说是非常重要的一步。网上有许多关于gRNA设计的心得,这里就不多说了。第三步,将gRNA克隆到质粒中,导入CRISPR元件克隆即普通的克隆。克隆完通过测序来验证最终的质粒产物。这一切看上去并不复杂,但若是自己动手设计,恐怕也不轻松。现在市场上一些公司已经推出了商业化的CRISPR/Cas9载体,将这些必要的元件组合成单个载体,简化了实验设计,例如GeneCopoeia。第四步,导入CRISPR元件在导入CRISPR元件时,若使用的是哺乳动物细胞普通的细胞系(如HeLa、HEK 293),那么常用的DNA导入方法都可以使用,如转染、病毒导入。而对于ES细胞和iPS细胞,电穿孔的方法效果会更好。对于原代细胞,病毒转导可能更理想。第五步,评估效果这又要回到实验目的了。如果你是选择修饰目的基因,那在设计所引入的外源序列时,可以加入示踪基因。如果是选择破坏目的基因,那你可以选择一些检测试剂盒。比如GeneCopoeia的IndelCheck™ CRISPR/TALEN 插入缺失检测试剂盒。其采用错配检测内切酶来检测细胞内NHEJ修复期间因插入或删除而产生的插入或缺失。试剂盒简便快捷,性价比高。当然,你也可以通过测序对序列进行验证。
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小树洞:你们工作后第一个月都得了多少工资呢?
妇产专硕18年刚毕业,四证合一。找了个市级三甲医院,合同的。工作一个月,当时发工资,968元。之前应聘的时候说前三月试用期1300 元。试用期过后加奖金,没想到,呵呵,租房一月1000元。今天直接崩溃。打算明天打电话问财务扣的都是什么钱,了解清楚后闪人。回家继承祖业—烤地瓜,烤玉米走起。你们工作后第一个月都得多少工资呢?
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