①如实验方案6所述裂解细胞。
②4℃条件下23000g离心细胞裂解液30min。
③倒出上清,测定沉淀的湿重。
④用约10倍体积的洗涤缓冲液重悬沉淀,室温搅动悬浮液1h。
⑤4℃条件下23000g离心混合物30min。
⑥除去上清,并重悬沉淀。
⑦重复④〜⑥步骤3次以上(直到重组蛋白的纯度>80%)。
⑧溶解步骤⑦的沉淀物,每克湿重沉淀(由步骤③决定)加入约8ml的溶解缓冲液,在4℃条件下温和搅动混合物16〜20min。
实验提示:蛋白浓度不要超过2〜3mg/ml其他的溶解缓冲液:
a.8mol/L盐酸胍,10mmol/L DTT,50mmol/L Tris-Cl(pH8.5)
每12〜15g湿重的收集细胞用15ml溶液溶解。37℃孵育混合物1h。如步骤⑨a.所述变性蛋白。
b.8mol/L脲素,2mmol/L还原型谷胱甘肽/0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽。
每克湿重包含体沉淀使用9倍体积的缓冲液。室温孵育混合物1h。蛋白浓度不要超过2.5mg/ml。如步骤⑨,b.所述复性蛋白。
⑨特定目的蛋白的重新折叠所需的最适条件必须通过预实验来选择。复性条件包括:
a.用1.5μmol/L硫酸铜、50mmol/L Tris-Cl(pH8.5)溶液将可溶性沉淀稀释25倍,至终浓度为0.04mol/L DTT、0.24mol/L盐酸胍和约1.4μg/ml的目的蛋白。20℃孵育混合物2h。
b.缓慢将9倍体积的50mmol/L磷酸盐、50mmol/L NaCl和1mmol/L EDTA(含2mmol/L还原型谷胱甘肽/0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽)加入溶解的沉淀中。25℃孵育混合物2〜4h。
⑩用适合于目的蛋白的浓缩步骤来回收重折叠的蛋白(如RP-HPLC、冻干或超过滤)。
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