一、探针
已经标记好的商品探针以混合形式溶解在杂交液中。
二、从组织中制备染色体
1.在组织培养用的超净工作台中进行无菌操作,在无菌培养皿中,用刀片将组织切碎成细小的块。
2.将细碎的组织块转入有足够培养基的、具有通气孔的组织培养瓶中;培养基要盖过平面放置的培养瓶底(通常10〜15mL)。
3.将培养瓶放入CO2培养箱中,静置培养24h。
4.光镜下观察其生长状态。
5.当达到要求的生长状态或培养时间时,向培养瓶中加入秋水仙胺至终浓度10μg/mL,在CO2培养箱中继续培养2〜3h。
6.将培养基和悬浮的组织或细胞一起转移到15mL锥形底离心管。对于非贴壁细胞,继续步骤10。
7.向培养瓶中加入10mL柠檬酸盐溶液,漂洗贴壁的细胞,弃去柠檬酸盐溶液。
8.向培养瓶中加入10mL 1×胰酶。观察贴壁细胞自培养瓶壁上脱离,轻轻吹打,将细胞自瓶壁上吹打下来,转移到15mL锥形离心管中。
9.向含有贴壁细胞的15mL锥形离心管内加入5mL新鲜配置的培基
10.1500g离心10min收集细胞。
11.倒掉或吸出上清,只留下0.5〜1mL溶液。用手指轻轻敲打管底,打散细胞团。
12.加人预热的0.075mol/L KCl溶液,开始的1mL逐滴加入,滴加中间混匀;然后将剩下的14mL加入并轻轻颠倒混匀,37℃放置10min。
13.加入5滴比例为3:1的甲醇:冰乙酸,混匀。
14.1500g离心10min。
15.倒掉或吸出上清,打散细胞团。加入新鲜配置的甲醇:冰乙酸(3:1)固定液15mL,用上述的方法开始的1mL逐滴加入,滴加中间混匀;然后加入剩余的14mL固定液,并轻轻颠倒混匀。
16.1500g,离心.10min。
17.重复步骤15的固定。然而,最初的1mL不需要逐滴加人。离心,重复固定3次。
18.细胞悬液可以以固定液中细胞团的状态-20℃保存。
19.为了进行染色体标本制备,倒掉固定液,重悬细胞团块,加入适量的新鲜固定液使悬液轻度浑浊。
20.用200μL的枪,吸取100μL悬液,滴到干净的载玻片上,室温下晾干并储存片子。滴好的片子至少自然老化2d或37℃过夜老化。
三、染色体标本预处理和变性
1.染色体标本至少自然老化2d或用前37℃过夜。
2.染色体标本在系列乙醇(70%、80%和95%)中分别脱水5min,晾干。
3.加入15〜20μL的10%胃蛋白酶储存液到50mL预热的0.01mol/L HCl中,将染色体标本在37℃染色缸中温育5min。同时,准备一缸70%甲酰胺/2×SSC溶液并放入75℃水浴中预热。
4.取出标本,在室温下的1×PBS中漂洗5min。
5.在1×PBS/MgCl2室温温育5min。
6.向50mL 1×PBS/MgCl2中加入1.5mL37%甲醛,在室温下的该溶液中温育标本10min。
7.在室温中的1×PBS中漂洗5min。
8.按步骤2中所述方法再次进行系列乙醇脱水。
9.晾干片子后,检查甲酰胺溶液的温度是否达到75℃;将染色体标本在75℃甲酰胺溶液中变性2min。
10.迅速将标本转移到冰冷的70%乙醇中并用系列乙醇脱水后晾干。
四、探针变性
1.对于每张标本,22mm×22mm盖玻片的范围内需要用10μL探针;如果该区域大于此范围,增加探针的使用量。取适量的探针到一个Eppendorf管中。
2.在水浴锅或PCR仪上75℃热变性探针10min。
3.将探针于37℃水浴中预复性1h。
五、杂交
1.从37℃中取出预复性的探针,小心的加到变性的中期染色体标本上。因为探针既有直接标记又有间接标记,应迅速操作并避免长时间暴露在光线条件下。
2.小心的盖上盖玻片,注意不要产生气泡。如果出现气泡,轻按盖玻片,将气泡挤出。
3.用橡皮泥封好盖玻片边缘。
4.放入杂交盒,并放入塑料袋中(可选择的),在37℃条件下杂交48h。
六、杂交后洗脱和检测
1.在45℃水浴中预热所有的溶液。
2.从杂交盒中取出片子,小心除去橡皮泥。盖玻片也许随橡皮泥一块揭去或仍留在片子上。如果盖玻片留在片子上,直接将标本放入第一缸洗脱液。
3.在50%甲酰胺/2×SSC中洗3次,每次5min。在第一次洗脱时盖玻片应滑掉。轻轻振荡染色缸几秒钟。
4.在1×SSC中洗片3次,每次5min并轻轻振荡。
5.标本浸在0.01%Tween-20/4× SSC中,取出标本,甩掉多余的液体,但保持片子表面湿润。
6.取30〜40μL SKY试剂盒(AppliedSpectralImaging提供)的瓶2中的封闭液加到标本上,盖上盖玻片。
7.将标本放回杂交盒,37℃温育30min。
8.小心移开盖玻片,取30〜40pLSKY试剂盒的瓶3中的检测溶液加到片子上,并盖上盖玻片。
9.将标本放回杂交盒,37℃温育约30min。
10.小心移开盖玻片,在0.01%Tween-20/4× SSC中洗3次,每次5min。轻轻振荡。
11.甩掉多余的液体,取30〜40μL SKY试剂盒的瓶4中的检测溶液加到标本上,盖上盖玻片。
12.将标本放回杂交盒,37℃温育30min。
13.小心移开盖玻片,在0.01%Tween-20/4×SSC中洗片3次,每次5min。轻轻振荡。
14.在室温下的2×SSC中漂洗片子。
15.用15〜20μL瓶5中的DAPI/抗淬灭剂封片,盖上盖玻片,避免产生气泡。
16.可以进行阅片。标本应在-20℃保存。
七、图像抓取
1.尽可能及时的进行图像抓取和分析。尽管荧光素在-20℃并尽可能少的光线条件下能保存几个月,但随着时间的延长,信号强度会减弱。'
2.在实验室安装系统时进行用该系统抓取图像和分析的培训。
八、用SKY探针与曾G显带过的中期染色体标本的杂交:标本预处理
1.在室温下的二甲苯中洗2次,每次5min,除去G带标本上残留的镜油
2.将标本浸在甲醇中10〜15min褪色,或直到标本完全褪色。
3.标本褪色后,进行系列乙醇再水合:95%、80%和70%乙醇,每5min,瞭干。
4.继续从三的步骤5开始。
5.如果标本曾显带过,在70%甲酰胺/2×SSC中变性时间需调整以反映标本特性。保守变性时间为40s。
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