标签: 缺口平移 分子细胞遗传学技术与应用第二章
来源:《分子细胞遗传学技术与应用》
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1.制备0.1mmol/L dTTP溶液:将100μL 0.3mmol/L dTTP加入到200μL无核酸酶的水中。
2.制备0.1mmol/L dNTP混合物:将0.3mmol/L dATP、0.3mmol/L dCTP和0.3mmol/L dGTP各100μL混合。多余的核苷酸混合物可在-20℃或-80℃保存。
3.对于每个标记反应,在放置在冰上的小离心管中加入1μgDNA、0.2mmol/L荧光基团标记的dUTP 2.5μL、0.1mmol/L dTTP 5μL、0.1mmol/L dNTP混合物10μL、10X缺口平移缓冲液5μL,加无核酸酶的水到40μL
4.每个小离心管中加入缺口平移酶混合物10μL。
5.混匀并稍离心。
6.在15℃条件下温育8〜16h。
7.加入5μL反应终止液。
8.为了去掉未掺入的核苷酸,加入乙酸钠、125μL无水乙醇,用12000r/min的离心速度离心20〜30min。小心地倒掉上清或用微量移液器吸去上清。加入100uL70%乙醇,稍振荡,用1500g离心5min。小心地倒掉上清或用微量移液器吸去上清
9..用真空冷冻干燥器处理样品.10〜20min。用10pLTE重悬沉淀,使终浓度约为100ng/μL。也可以用Sephadex050型离心柱去掉未掺入的核苷酸,操作步骤按照产品说明书进行。用离心柱处理后,标记DNA体积范围为50〜100μL,然后按照步骤8进行浓缩。
10.为了确定标记DNA片段的大小,在50mLTAE或TBE缓冲液中加入0.5g琼脂糖,用微波炉或电热板小心加热至沸腾。当琼脂糖全部溶解,在水浴中降温至55℃。
11.在琼脂糖中加入2.5μL EB混匀后,将琼脂糖倒在具有12孔或16孔梳子的铺胶板上。
12.对于每个标记DNA样品,将2μLDNA(约200ng)、7μL水(TAE或TBE)和1μL上样缓冲液混合。
13.将每个标记样品和分子质量参考在70〜100V下电泳,直至前面的染液在凝胶中迁移约5cm。
14.在紫外投射反射仪上观察DNA,并拍照。大部分的DNA片段应在200〜600bp。
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