标签: MALDl-MS 蛋白质组学:从序列到功能第五章
来源:《蛋白质组学:从序列到功能》
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线性 MALDI-MS:MALDI-MS质谱仪恐怕是概念上和设计上都最简单的质谱仪,分子(分析物)经 MALDI 方式离子化,离子的质荷比 (m/z)由飞行时间质分析器检测(见图 5,1) 。 测量的质量精确度与m/z有关, 25ku 以下可达到约 0.01%-0.05% 的精确度,到 300ku 精确度达到±0.05% --0.3%。MALDI 也能分析溶解在磷酸盐, Tris等生物缓冲液中的分析样品,或含有少量脲、非离子变性剂及一些碱金属盐的样品溶液。
蛋白质和多肽的 MALDI 分析包括以下一系列步骤
(1) 被分析物与基质(小分子芳香化合物)混合。基质通常溶解在酸性有机溶剂中,以超过样品 1000 倍的量与样品混合,将样品和基质加到金属片/靶上,溶剂在空气中挥发后,形成了样品-基质共结晶.,
(2) 将加有样品-基质混合结晶的靶送入质谱仪的真空室 (10-5-10-8Torr) 。
(3) 在金属片/靶上加+ 20-30kV 的高电压(产生正离子),同时有短的激光脉冲照射在干燥的样品上。
(4) 基质晶体吸收特定波长的激光能量(紫外激光 337nm, 红外激光 2.94μm, 又以热的形式将能量释放 引发了解吸附这一迅速的放热过程又使基质品体升华,基质和样品分子气化进入质谱仪的气相。
(5) 通过在气相中发生质子化/去质子化,附着阳离子/脱离阳离子,或氧化/还原等过程实现离子化。产生的离子从靶表面(保持 +20-30kV 高电压)被推斥并加速进入一系列的离子透镜(保持接地电压),离子透镜聚焦离子进入飞行时间质量分析器的无场漂移区 (50-300cm) 贮检测器安装在无场漂移区末端,通过飞行管道的离子被检测器记录。
(6) MALDI 离子化过程送入质量分析器的离子实质上具有相间的终动能。在动能定时离子的速度与离子的质荷比m/z成反比。因此,线性检测器中,离子到达飞行管道另一端检测器的时间反映被检测离子的m/z。
(7) 离子通过无场漂移区的飞行时间由激光脉冲面向发检测器记录。因此,每一离子化过程 产生的每批离子到达检测器的飞行时间都被记录下,并被换为质荷比m/z。
离子越小,飞行速度越快,因此质荷比m/z可用已知质量和电荷状态的化合物的飞行时间作校正并用经验公式计算出来(通常用一个基质离子和一个蛋白质或多肽离子作校正,被分析物的质量包括在此质量范围内)。离子动能 (E)与其质量 (m) 和速度 (v) 的关系可被表述为 E=1/2mv2。因此,对于一个单电荷离子,其飞行时间(由速度决定)与分子质量的平方根成反比。
通过以下步骤实现:在飞行器未端放置的反射器上施加高电压,其电压值比离子源的电压值稍高,进入反射器的离子在电场作用下方向偏转,直至停止飞行,然后在反射器内被赋新加速飞出反射器进入第二检测器(Ill 5. lb) 。反射器充当了一个能量聚焦装置,因为动能稍小的离子(速度慢),进入反射器的距离短,折返也较早,动能稍大的离子进入反射甜的距离长,折返较晚,所以速度慢的离子赶上速度快的离子,反射器的应用减少了离子初始动能的分散,因此提高了质量分辩率,第二种用来修止 MALDI 离子化过程中初始能景分散的技术是在离子源内实现的,由 Wiley 和 McLacen 在 1953 年提出, 称为时间延迟聚焦, 最近被称为延迟提取 (delayed extraction)在图 5. lb 和 c 中村到,相对于连续离于提取(图 5, la), 延迟提取是在样品靶和接地的连续离子提取透镜之间又加了二级离子透镜(施加电压),延迟提取时,MALDI 在无电场区域产生离子,在施加提取电压使离子加速进入飞行管道之前,离子可以四处分散今这样显著降低了离子的能低分散,同时也限制了峰的展宽,峰的展宽通常是由于在连续离子提取模式下源内离子碰撞产生不稳定的解离所致也延迟提取使线性 MALDI 质谱仪分析多肽的质量分辨率达到 2000-4000, 便反射 MALDI 质谱仪分析多肽的质量分辨率达到 3000-6000 。
PSD-MALDI-MS 为了在MALDI-MS仪器上获取一级结构信包,必须选择分析某一离子及其碎片离子的质量 这一过程发生在源内离子化之后,所以被称为源后衰变 (post source decay, PSD) 。对多肽进行 PSD 分析时,其碎片离子主要是沿多肽骨架断裂形成,产生的一系列碎片离子在理论上包含若这-肽段的氨基序列信息,离子源内产生的离子被加速后在飞行过程中产生的碎片离子是亚稳离子, 所有的碎片离子都具有与其前体离子相同的速度,但只具有前体离子动能的一部分分。所有的离子, 包括前体离子和碎片离子,由于具有相同的表观质荷比,都将在同一时间到达线性检测器,所以在线性 TOF 分析器中,不能分辨碎片离子与前体离子但是使用离了镜(反射器)可以分辨碎片离子与前体离子的动能差异,现在有两种反射器 双程 (dual-stage) 反射器和环场 (curved-field) 反射器,双程反射器只能在有限的动能范围内聚焦离子,为了使较宽动能范围的离子都被聚集,反射器电压要逐步减少,连续降 7 -14 步,聚焦动能越来越小的离子,收集到最后一张谱图时,反射器电压大致是初始电压的 5% -10% 。由数据系统整合出连续完整的碎片离子谱图,并根据每一反射电压下的碎片离子校正谱图进行校正,环场反射器能在一次试验中分辨出所有的碎片离子。环场反射器是由一系列电压逐渐减小的离子透镜组成的长反射器(图 5.k), 因此聚焦不同质荷比的碎片离子所需的电压一直存在,但是在空间上是可以分辨的。在同,激光脉冲下如果产生多个肽段离子,在没有质量过滤器时,不能区分不同肽段产生的碎片离子,也不能区分碎片离了与未断裂的肽段离子。因此,装备有以上任一种反射器的质谱仪都安装了一个离子门 (ion gate), 可以在低分辨率情况下(± 2.5%) (图 5, lb 、 c) 选择前体离子/碎片离子。所以,在一个未经分离的肽混合物中,可以选择多个肽段得到其序列特异的碎片离子信息。
树洞:你的导师是「魔鬼」还是「天使」?
你们导师都对你们怎么样?羡慕那些神仙导师……
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蛋白质组学 从序列到功能
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