标签: 神经系统免疫性疾病模型 神经生物学实用实验技术第四章第八节
来源:《神经生物学实用实验技术》第四军医大学出版社
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神经系统自身免疫性疾病是以自体免疫细胞、免疫分子等攻击神经系统为主要病理机制的自身免疫性疾病,可发生在中枢神经系统、周围神经系统及神经-肌肉接头处,导致神经元或轴索损伤、髓鞘脱失、神经-肌肉接头破坏等病理改变。在中枢神经系统以多发性硬化(MS)、视神经脊髓炎(NMO)为代表。在周围神经系统以急性炎性脱髓鞘性多发性神经病(AIDP),如格林-巴利综合征(CBS)为代表。神经-肌肉接头病变以重症肌无力(MG)为代表。
相应的动物模型已经建立。如MS的动物模型为实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis, EAE),MG的动物模型为实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis, EAMG)和CBS的动物模型为实验性自身免疫性神经炎(experimental autoimmune neuritis, EAN)。根据模型诱导方案的不同,神经系统免疫性疾病动物模型可以分为主动免疫、被动转移和病毒感染三类。其中主动免疫模型被应用的最为广泛,也最能反映疾病的发生发展过程。被动转移模型是采取已发生疾病的动物外周血或淋巴结淋巴细胞被动注射给同品系健康动物,而导致其发病。虽然被动转移产生的动物模型在病理上和相应疾病类似,但是由于其产生过程、发展进程和疾病不同,因此主要用在探索EAE和MS的机制上。
(1)免疫原的制备MOG35-55片段,其氨基酸序列为MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK,由公司合成(2)免疫方案包括:①第一次免疫(Od)异氟醚吸入麻醉下,MOG35-55:FCA(1:1)混合液4ml,百日咳杆菌菌液:PBS(1:50)混合液0.2ml于足垫处皮下注射;②第二次免疫(7d) 异氟醚吸入麻醉下,MOG35-55:FCA(1:1)混合液4ml,百日咳杆菌菌液:PBS(1:50)混合液0.2ml于肋下皮下两侧皮下注射。
结果判读:成功模型的动物可出现体重下降、食量减少、肢体瘫痪、大小便失禁甚至死亡。形态学检查可见到中枢神经系统内不同程度的炎性细胞浸润和脱髓鞘,部分动物可同时合并轴突变性。存活者常在注射抗原后3周左右症状自行缓解,1月左右基本恢复。随症状缓解,体重也逐渐恢复。
(1)Pluchino评分法通常使用Pluchino的方法进行评定,标准如下:①1级部分尾巴下垂;②2级完全尾巴下垂;③3级完全尾巴下垂和站立行走缓慢;④4级后肢部分瘫痪;⑤5级后肢完全瘫痪;⑥6级濒死状态。
(2)取材Lewis大鼠由10%水合氯醛腹腔麻醉后,左侧臀部剪毛、消毒,分离出脑和脊髓,4%甲醒固定,纵向包埋,常规石蜡切片。
(3)染色与观察苏木精-伊红染色观察Lewis大鼠脑和脊髓神经组织切片淋巴细胞、巨噬细胞等炎性细胞的浸润情况。可见脊膜及中央管周围有明显的淋巴样组织浸润、增厚,脊髓白质内有细胞浸润的小灶状病变及静脉周围呈套袖样浸润。神经细胞有坏死,细胞核消失呈匀质小体,或细胞体消失留下一空隙,以及细胞周围有圆细胞浸润等。在脑组织中可见到脑膜增厚,淋巴样细胞及单核细胞浸润。室管膜及脉络膜亦呈同样变化。小静脉及毛细血管周围,则呈套袖状细胞浸润。脑实质内有小胶质细胞组成的浸润灶。有些星状细胞呈核碎裂、胞浆苍臼、细胞变形等。LuxolBlue髓鞘染色法观察Lewis大鼠脑和脊髓神经组织切片髓鞘脱失程度。
(1)动物选择不同种属动物对EAE敏感性不同,因而EAE的建立与选择的动物种属关系很大。经免疫遗传研究发现EAE的发生受遗传因素制约,EAE的易感性受免疫反应基因影响,它直接控制实验动物对抗原刺激的免疫反应。因此,在选择动物时需要寻找EAE模型的敏感动物,如SJL/J、BIOPL小鼠、Lewis大鼠、豚鼠、日本大耳白兔、新西兰白兔、恒河猴和食蟹猴等都是良好的EAE敏感动物。
(2)抗原的种类、选择和制备EAE的致脑炎抗原具有器官特异性,而没有种属特异性,存在所有温血动物中枢神经系统的白质内。从始至今使用的致脑炎抗原的种类有同种型、异种型或同种异型温血动物的全脑、脊髓组织匀浆或其中的白质,髓鞘蛋白脂蛋白,髓鞘碱性蛋白,用消化酶分解后的肤片,大脑内皮细胞膜以及MBP特异性T淋巴细胞。通常不同品种动物对同一抗原的敏感性不同、不同抗原的抗原性也不同,并且不同来源的同一抗原的活性也有明显差异。一般情况下,抗原性强弱依次为豚鼠脊髓>大鼠脊髓>牛脊髓,脊髓组织>脑组织,豚鼠MBP>牛MBP。目前最被广泛接受的是使用MOG35-55片段,其氨基酸序列为MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK。MOG在髓鞘蛋白中含量很少,只占总髓鞘蛋白成分的0.01%-0.05%,但由于它存在于髓鞘膜和少突胶质细胞的最外层,故具高度免疫原性。因此,研究MOG诱导的EAE模型可以为更好的阐明MS的发病机制提供重要信息。近年来,用MOG诱导EAE逐渐成为国际上研究MS的主要模型。
(3)致敏方法致脑炎抗原的免疫途径有多种,如皮下、皮内、肌肉、腹腔和静脉注射。其中皮下多部位注射致脑炎抗原诱发EAE的发生率最高,因而常用的注射途径是皮下注射。EAE的产生不仅与实验动物和致脑炎抗原有关外,而且与致敏方法密切相关。由于致敏方法的不同,可诱导产生超急性、急性和慢性病程的EAE。具体实施方案如下:
①若给实验动物一次注射大剂量致敏原和CFA,同时注射百日咳菌苗,动物免疫后7-8d发病,这就是超急性EAE;
②若给实验动物一次注射较大剂量的致敏原和CFA,动物在注射后2周左右发病,这就是急性EAE;
③若给实验动物间隔一周注射较小剂量的致敏原和CFA,急性起病后有缓解复发的病程,或急性EAE经不当治疗也可有缓解复发,这些均是慢性复发性EAE。
(1) 周围神经髓鞘的制备自牛脊神经根提取周围神经髓磷脂(bovine peripheral mylin,BPM):
①取牛硬脊膜内神经根,-70℃冻存;②室温融溶,剪碎,与0.3M蔗糖溶液混合,使用组织高速离散器制成5%(w/v)组织匀浆;③离心管中加入0.5M蔗糖溶液,再加入0.3M蔗糖组织匀浆(比例1:1),96000g,离心60min; ④收获界面(乳白色中间层),加入蒸馏水悬浮,96000g,离心20min; ⑤取沉淀,对蒸馏水4L透析24h; ①~⑤步骤均在4℃操作。⑥-70℃冻干,-20℃保存备用。
(2)模型制备方法包括:①第一次免疫(Od)异氟醚吸入麻醉下,背部四个不同位置进行皮下注射,剂最为50µL的完全乳化液(200µg PO106-125+25µL盐水和0.5mg结核分枝杆菌+25µL弗氏不完全佐剂);②第二次免疫(7d) 异氟醚吸入麻醉下,背部4个不同位置进行皮下注射,剂釐为50µL的完全乳化液(200µg P0106-125+25µL盐水和0.5mg结核分枝杆菌+25µL弗氏不完全佐剂)。
结果判定:成功模型主要表现为动物体重不增,运动迟缓,先后出现两后肢无力、瘫痪,严重者累及前肢,甚至呼吸困难、死亡。
(1)临床评分分为:①0正常;②0.5全尾肌张力下降;③1.0尾部肌肉瘫,松软拖地;④1.5轻微后肢无力,肌张力下降;⑤2.0明显后肢无力或轻度后肢瘫;⑥2.5中度后肢瘫;⑦3.0严重后肢瘫;⑧4严重四肢瘫。
(2)取材Lewis大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉后,左侧臀部剪毛、消毒,分离出坐骨神经,剪取靠近脊柱侧坐骨神经长约1cm,4%甲醛固定,纵向包埋,常规石蜡切片。
(3)染色与观察苏木精-伊红染色观察Lewis大鼠坐骨神经组织切片淋巴细胞、巨噬细胞等炎性细胞的浸润情况;固绿髓鞘染色法观察Lewis大鼠坐骨神经组织切片髓鞘脱失程度
(1)动物选择Lewis大鼠、SJL小鼠、豚鼠、兔、猴、羊均可作为敏感动物来诱导EAN,其中豚鼠和SJL小鼠的使用最为广泛。
(2)抗原的种类、选择和制备近年来在研究诱导EAN的免疫原方面有了很大进展,从最初用周围神经组织匀浆诱导EAN逐步发展用周围神经系统的髓鞘P2蛋白、P2蛋白特异性T细胞株、P2中提取的肽段及人工合成肽段作为EAN的免疫原。MBP包括PO、Pl、P2,PO不具有免疫原性,Pl存在于中枢及周围神经中,用Pl蛋白加上完全佐剂免疫动物可诱发EAE和EAN,P2只存在于周围神经中,用P2加上完全佐剂免疫动物只会产生EAN,不产生EAE。最主要的模型是采用敏感鼠种Lewis大鼠。可用纯化的周围神经髓磷脂,牛的P2蛋白,重组人的P2蛋白或P2蛋白肽53-78主动诱导。SJL小鼠可有中度临床症状和组织学损害,Balb/c小鼠对该模型相对抵抗。
(1)免疫原的制备人工合成加利福尼亚电幔AchR-a的146-162序列片段作为免疫原,其氨基酸序列为Ala-Ile-Phe-Lys-Ser-Tyr-Cys-Glu-Ile-Ile-Val-Thr-His-Phe-Pro-Phe-Asp。
(2)模型制备程序为:①将合成多肽20µg溶解于100µL的PBS缓冲液中(pH7.2),并加入等量的CFA,充分混合,直到水溶液完全被油滴吸附;②皮下注射接种于背部6处(每处20µL)、两后肢垫(每处20µL)和尾基部(40µL); ③将合成多肽20µg溶解于50µL的PBS缓冲液中(pH7.2),并加入等量的不完全弗氏佐剂,充分混合;④混合注射于背部3处(每处20µL)和尾基部(40µL)。;
结果判定:对于实验性自身免疫性重症肌无力动物模型来讲,单纯的症状如体重下降,活动、进食减少、闭目等并无特异性。血清抗体检查存在抗体阴性和检出率的问题。动物电生理的检查,存在一些干扰因素,不能排除误差。因此必须综合多个指标进行分析,其中症状、AchR-Ab抗体滴度和电镜结果最有意义。
(1)临床症状按照Lennon分级法将症状严重程度分为:
①0级没有肯定的无力表现;②1级撕咬无力,四肢力量较差,在光滑地面上前肢打滑,活动减少且易疲劳;③2级明显无力,休息时身体呈隆起姿势,头尾下垂,大腿外展,前肢(趾)弯曲,动作笨拙,步态不稳;④3级严重无力表现,无撕咬动作,肌肉震颤,呼吸困难,濒死或死亡。症状居于中间者,分别评为0.5、1.5和2.5级。每天按照以上标准观察并记录症状变化。
(2)电生理检查用水合氯醛溶液将小鼠麻醉后固定在木板上,将成对刺激电极以2-3mm距离插至坐骨切迹附近肌肉内,记录电极置于胖肠肌内侧头(跟腿附着处),重复用50-100Hz电刺激,并记录小鼠排肠肌电位及收缩波幅。成功模型可见重复神经电刺激呈衰减反应。
(3)电镜检查通常将小鼠断颈法处死,在解剖显微镜下沿坐骨神经分离组织,于腓肠肌终末分支处迅速取其排肠肌组织进行透射电镜观察。成功模型大鼠神经肌肉接头褶局部紊乱、溶解、消失,突触前膜囊泡减少,线粒体等细胞器空泡化。
(4)AChR-Ab滴度检测免疫后7周经颈动脉采血分离血清,采用ELISA测定AChR-Ab含量。按公式:P/N=待测血清D(λ)490nm/正常组D(h)490nm计算。以P/N值≥2.l为阳性,≤1.4为阴性,介于两者之间为可疑阳性
(1)动物选择大鼠、小讯、豚鼠、家兔及猴均可诱导产生EAMG,但是不同种属动物易感性不同。目前最常用到的实验动物为大鼠和小鼠,且大鼠EAMG模型和人类更为接近。大鼠近交品系对该模型的易感性依次为Wistar > munich > fischer > Lewis > Buffalo > Brown > Norway > ACI > Wistar Kyoto > Kopen-hagen > Wistar Furth,因此最常使用Wister大鼠作为实验对象。随着转基因小鼠的普遍使用,小鼠EAMG模型也逐渐受到重视,目前发现,C57BV6、SJL和AKP易感性较高,而SWR、BALB/c和C3H/He易感性较低。
(2)抗原的种类、选择和制备传统方法采用加利福尼亚电鳗电器官分离乙酰胆碱受体(AchR)免疫大鼠建立EAMG模型。随着基因克隆技术的发展和人类对乙酰胆碱受体亚基及其氨基酸序列的深入研究,可以通过人工合成加利福尼亚电绶的AchR-o146-162序列片段作为免疫原,其氨基酸序列为:Ala-Ile-Phe-Lys-Ser-Tyr-Cys-Glu-Ile-Ile-Val-Thr-His-Phe-Pro-Phe-Asp。此外,Angela等用人类AChR-a的138-167、157-188、185-199、309-345和338-368片段作为免疫原对兔进行动物模型的制备,结果证明AChR-0138-167片段的成功率最高。
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