线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞 (MCAO) 模型

脑血管疾病是人类发病率最高的疾病之一，模拟临床疾病，制作较为可靠的脑缺血动物模型显得尤为重要。根据实验目的不同，可以制备全脑缺血模型和局灶性脑缺血模型。大脑中动脉(MCA)是人群脑卒中的多发部位，MCA闭塞模型(MCAO)被普遍认为是局灶性脑缺血的标准动物模型，制作方法主要有以下几种：开颅结扎法(Tamura等采用颇下部开颅，分离近端MCA,电凝或用手术丝线结扎MCA,造成脑梗死，是目前公认的标准MCAO)、光化学法(Watson等首次建立了光化学法诱导脑皮层梗死的动物模型，即采用立体定位仪固定大鼠头部，暴露颅骨，尾静脉注射光敏材料荧光素Rose Bengal,用560nm波长的特定光源照射局部头颅，光线透过颅骨与血管内的染料接触，激发光化学反应，引起照射部位皮层血管内皮细胞毒性脑水肿而导致脑梗死）、栓塞法(Kudo等采用<100µ,m的同源血凝块栓子悬液，注入颈总动脉CCA,在颈外动脉ECA的颈内动脉ICA开口处置一可逆性插管，栓子则由ICA进入MCA,导致同侧大脑皮层、海马、深层灰质结构的梗死；也有人用碳素颗粒、花生四烯酸钠作为栓塞剂制成脑梗死模型），以及我们要详细介绍的线栓法。线栓法用于制作局灶性脑缺血模型的实验研究，其基本原理是用线栓阻闭大脑中动脉起始部，造成大脑中动脉供血区缺血，从而使大鼠发生局灶性脑缺血。此方法的特点是稳定性好、重复性好、损伤小、梗死部位确切和成功率高。

1.制备线栓，选择3-0的尼龙线27mm,头端用酒精灯加热成直径为0.33mm的半球形，并用硅胶脂涂抹。

2.250-300g大鼠，2%戊巴比妥钠每千克体重40-60mg腹腔注射麻醉。

3.动物麻醉后仰卧固定于手术台上，用肛温探头测定大鼠肛温，取肩肿连线以上正中切口，用血管钳垂直钝性分离甲状腺连接部，暴露颈部肌群。

4.钝性分离由二腹肌，胸锁乳突肌和肩脾舌骨肌组成的肌间隙，暴露右侧颈总动脉和迷走神经，再逐步暴露颈总动脉分叉，颈外动脉和颈内动脉。

5.然后用3-0的手术线结扎颈外动脉远心端和颈总动脉近心端，并用手术线紧拉颈内动脉使与颈总动脉成一条直线。

6.通过Longa评分法或者Garcia评分法，以及脑梗死容积的测定，来筛选和判断模型制作是否成功。

Longa评分法： 6级评分法

①0级无功能障碍；②1级不能伸展左侧前肢；③2级向左侧旋转；④3级向左侧倾倒；⑤4级无自主活动伴意识抑制；⑥5级死亡。初步评定模型的成功与否，将评分在1-3级的动物纳入下一步实验，其余动物予以排除。

Garcia评分法：

Garcia评分法最低为3分，最高为18分，得分越高表明动物的神经行为学状况越好。其中前4项评价动物的运动功能，后2项评价动物的感觉功能。3-7分为重度神经功能障碍，8-12分为中度神经功能障碍，13-16分为轻度神经功能障碍（表4-3片将评分在7-13分的动物纳入下一步实验，其余动物予以排除。

7.脑梗死容积的测定：

用TTC染色来确定脑梗死容积。

(1)断头处死动物，迅速取出鼠脑，置于冰盐水中10min。

(2)于脑槽中取冠状面均匀切成2mm厚脑片，迅速放入2% 2,3,5-氯化三苯四唑(TTC)溶液(37℃)中染色30min,然后用4%多聚甲酸固定。

(3)24h后用数码相机拍照，输入计算机，用图像处理软件(ADOBE,PHOTOSHOP)计算梗死面积，粉红色区为正常脑组织，白色区为梗死区。

(4)为减少脑缺血半球水肿对结果带来的影响，梗死容积采用损伤对侧正常组织容积减去同侧正常组织容积的办法来计算，结果用梗死容积百分比表示。梗死容积百分比＝（对侧正常组织容积－同侧正常组织的容积）／对侧正常组织容积X100%。

1.在尼龙线的选择方面，可供选择的有3-0和4-0等规格，动物体重在250-300g时，选择3-0的尼龙线。

2.小鼠程序同大鼠，所选动物体重范围20-25g,线栓用6-0,线栓头0.1mm左右，深度9mm左右。

3以下二条，有一条满足应将实验动物剔除：

① 手术过程中出血过多，3h未苏醒者应剔除；②Longa评分法是0分，或Garcia评分在0-6，14-18分的大鼠应当剔除；③颅底出血的动物也应剔除（判断颅底出血的方法是将大鼠大脑取出后观察大脑中动脉起始部有没有出血块）。

1动物麻醉对手术后死亡率有很大的影响，麻醉药最好现用现配，未用完的麻醉药最好4℃保存。

2.手术过程中分离血管时动作要轻柔，以免对迷走神经造成损伤。牵拉血管时应将颈内动脉和颈总动脉摆成一条直线，这样可以减少放线栓时插入翼鄂动脉的概率。

3.在插入线栓时，感觉到有阻力时用镊子尖部轻轻推一两下，但不能用力过大。这样既可以保证模型的成功率也可以减少颅腔内出血的可能。

4.手术完成后结扎颈内动脉时一定要注意扎紧，以免线栓拖出。