标签: 酶 氨基 聚酰胺 部分水解 固定化 酶学实验手册第五章
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聚酰胺的部分水解是酶固定的一种简单的方法,然而,必须注意避免聚酰胺结构的大量分解。固定的反应有 4 步:
1. 聚合体材料的蚀刻法用于增加表面区域和亲水性;
2. 氨基的部分分裂;
3. 自由氨基或羧基的活化;
4. 酶结合到有活性的聚合物上。
1. 聚胺的蚀刻
合成聚酰胺外套的小片(如 2 cm2,10 片)被浸没在 250 ml 圆底的长颈瓶中,长颈瓶中装有 18.6%(质量分数)CaCl2 和 18.6%(质量分数)甲醇的混合物。长颈瓶用旋转蒸发器 50℃ 旋转 20 min(无需真空)。然后,将小片在吸滤器或玻璃料上用水充分冲洗。
2. 氨基化合物的部分裂解
2.1 水解分裂。聚酰胺小片浸没在 3.65 mol/L 盐酸中用旋转蒸发器 50℃ 旋转 40 min (无真空)。其后该小片在吸滤器或玻璃料上用水充分冲洗,最终用 0.2 mol/L pH 8.5 的硼酸盐缓冲液冲洗。
2.2 非水解分裂。聚酰胺小片浸在甲醇中,在 25 ml N,N-二甲基-1,3-丙烷二胺中 70℃ 孵化 12 h 之后,干燥聚酰胺小片。氨基在吸滤器或玻璃料上用水冲洗除去。
3. 自由氨基的活化
经水解分裂、非水解分裂或置换之后的聚酰胺小片放在 25 ml 溶有 50 g/l 戊二醛的 0.2 mol/L pH 8.5 磷酸盐缓冲液的圆底长颈玻璃瓶中(无真空),在旋转蒸发器中 20℃ 旋转 15 min。过量的戊二醛在吸滤器或玻璃料上用 0.1 mol/L pH 7.5 磷酸钾充分冲洗除去。
4. 酶结合到活性聚酰胺。
在冲洗聚酰胺小片之后,马上添加酶溶液(0.2~0.5 mg/ml 溶于 0.1 mol/L pH 7.5 的磷酸钾,小片必须完全沉浸在溶液中)在 4℃ 孵化 3 h。在玻璃料上用溶有 0.5 mol/L NaCl 的 0.1 mol/L pH 7.5 磷酸钾冲洗,除掉没有被固定的酶。其后,用 0.1 mol/L pH 7.5 的磷酸钾冲洗来降低髙盐的浓度。如果短期储存,固定了酶的小片保存在 4℃ pH 7.5 的 0.1 mol/L 磷酸钾中。如果长期储存,这些小片迅速用水冲和用空气干燥(这个过程对于很敏感的酶是不能承受的)。
酶溶液(0.5 mg/ml 酶溶于 0.1 mol/L 磷酸钾,pH 7.5)
2. 试剂
0.2 mol/L 硼酸盐(硼酸/硼酸钠)缓冲液,pH 8.5
甲醇
50 g/L 戊二醛
CaCl2
3.65 mol/L HCl
N,N-二甲基-1,3-丙烷二胺
0.1 mol/L 磷酸钾,pH 7.5
0.5 mol/L NaCl 溶于 0.1 mol/L 磷酸钾,pH 7.5
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