1.培养细胞钙成像:
(1)标本制备大鼠或小鼠颈椎脱臼致死或缺氧致死,取材、分离打散细胞然后对其进行培养3-7d。
(2)Fura-2AM溶液制备将Fura-2AM首先溶解在DMSO中制备成1OmM的储备液,然后分装置于-20℃。在当日实验时将1OmM的Fura-2AM与助扩散剂PluronicacidF-127(20%)溶解在Ringer液中,具体配方如表3-l。 (3)iura-2AM负载细胞将上述配置好的Fura-2AM溶液加入培养细胞(24孔板)中室温孵育30min,之后吸出Fura-2AM溶液加入正常Ringer液洗脱30min,待用。整个过程中24孔板外用锡箔纸包被注意避光。
(4)培养细胞钙成像将Fura-2负载后的细胞置入荧光显微镜载物台上,相继应用340nm和380nm的激发波长各曝光30s,曝光频率为1Hz,计算F340/F380比值代表相对钙水平。灌流给予某种可以诱发胞内钙升高的激动剂时,便可以观察到荧光强度的改变,具体表现为340nm激发波长下的荧光强度增加,而380nm激发波长下的荧光强度减弱,因此F340/F380比值增大•.
2.急性组织薄片钙成像;
(I)标本制备大鼠或小鼠腹腔注射乌拉坦麻醉后,取材,在振动切片机上切取350-450µm厚的组织薄片(脊髓片或脑片),置于通有95%02和5%C02的混合气的人工脑脊液中孵育。
(2)Fura-2AM(1OµM)溶液制备同上,将Fura-2AM首先溶解在DMSO中制备成1OmM的储备液,然后分装置于-20℃。在当日实验时将1OmM的Fura-2AM与助扩散剂PluronicacidF-127(20%)溶解在人工脑脊液(ACSF)中,具体配方如表3-2。 (3)Fura-2AM负载细胞将组织薄片(脊髓片或脑片)放置在上述配制好的Fura-2溶液中孵育45min,负载完成后将其放置在无Fura-2的正常人工脑脊液中洗脱30min,然后开始进行钙测定。注意整个过程中持续通95%02和5%CO2的混合气体,并且在避光下进行。
(4)组织薄片钙成像将Fura-2负载后的组织薄片(脊髓片或脑片)置人荧光显微镜载物台上,相继应用340nm和380nm的激发波长各曝光30ms,曝光频率为1Hz,计算F340/F380比值代表相对钙水平。如彩页图3-14所示,电刺激背根后诱发脊髓背角浅层区域细胞的钙水平显著升高,具体表现为340nm激发波长下的荧光强度增加,而380nm激发波长下的荧光强度减弱,因此F340/F380比值增大。
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