标签: 病原微生物染色 免疫组织化学实验技术及应用 第十五章
病原微生物的种类繁多,包括属于真核微生物的真菌、厉于原核微生物的细菌(抗酸杆菌)、来自病毒的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)等。这些物质的化学成分中,含有不同的黏多糖、酸性蛋白和脂蛋白成分。染色后,通过氧化剂或直接加热条件下,可使染色剂与物质结合而形成牢固的复合物。内容来源《免疫组织化学实验技术及应用》
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真菌是常见的致病菌,其成分含有较多的黏多糖和蛋白质,通过氧化剂,能够促使菌壁的多糖暴露出醛基,然后再与 Schiff 试剂进行结合,生成新的复红复合物而显示真菌的存在,常用高碘酸-复红染色法。
高碘酸氧化剂:高碘酸 0.5 g,蒸馏水 99 ml。
Schiff 试剂染色液(参见糖原染色液)。
1. 石蜡组织切片,常规脱蜡至水。
2. 高碘酸氧化剂处理 10 min,流水洗 2 次。
3. 蒸馏水洗 2 次,Schiff 试剂染色液处理 20 min 左右,15℃ 以下时在湿盒内加入 50℃ 温水,可加快染色时间。
4. 浸入自来水洗 2 min,明矾-苏木精进行复染 10 s。
5. 无水乙醇脱水,二甲苯透明和中性树胶封固。
1. 高碘酸氧化剂置冰箱内保存,可用较长时间。
2. Schiff 试剂染色后,不宜水洗时间较长,以免背景较深。
结果:真菌呈紫红色,背景无色。
细菌体积较小,可在显微镜油镜下进行观察。细菌中的酸性蛋白质,通过革兰(Gram)碱性染料进行结合,遇革兰碘以后形成复合物,再经过分化剂,则显示革兰阳性菌(+)和革兰阴性菌(-)。常用 Gram 碱性复红-结晶紫革兰法。
苯胺油-石炭酸-复红染色液:碱性复红 0.5 g,苯胺油 1 ml,石炭酸(苯酚)1 g,30% 乙醇 70 ml。先将碱性复红溶解于乙醇,加热、冷却后再加入石炭酸和苯胺油。
革兰碘液:碘片 0.5 g,碘化钾 1 g,蒸馏水 150 ml。
结晶紫染色液:结晶紫 2 g,95% 乙醇 20 ml,草酸铵 1 g,蒸馏水 80 ml,分别将结晶紫溶解于乙醇,草酸铵溶解于蒸馏水,然后进行混合,可使用较长时间。
2. 苯胺油-石炭酸-复红染色液染色 5 min,自来水洗 1 min。
3. 蒸馏水洗后,用 40% 甲醛处理 1 min。
4. 蒸馏水洗 1 min,苦味酸饱和液处理 2 min。
5. 95% 乙醇快速处理一下,即放入水中,可见组织变红色。
6. 蒸馏水洗 1 min,结晶紫染色液染色 2 min。
7. 自来水洗后 1 min,蒸馏水洗 2 次。
8. 革兰碘液处理 2 min,水洗后用滤纸吸干。
9. 苯胺油与二甲苯等量混合液,进行分化(镜下控制分化程度)。
10. 二甲苯透明,中性树胶封固。
1. 苯胺油-石炭酸-复红染色液易产生结晶,染色时适当加热,防止切片污染。
2. 苯胺油与二甲苯分化时,应将切片摇动,便于分色均匀。
结果:革兰阳性菌呈蓝色,阴性菌呈红色。
结核杆菌和麻风杆菌通常称为抗酸杆菌,由于菌体内含有脂质蛋白质和多糖类物质,并由糖脂形成一个蜡质的外壳,当染色剂结合形成复合物后,用含酸分化剂处理也不易脱色,具有抵抗酸的作用,所以被称为抗酸杆菌。常用 Ziehl-Neelsen 抗酸杆菌染色法。
石炭酸-复红液:碱性复红 1 g,纯乙醇 10 ml,石炭酸(5%)水溶液 100 ml,碱性复红溶于乙醇内,然后与石炭酸水溶液混合,用前过滤。
2. 浸入石炭酸-复红液 1 h,于 37℃ 或 56℃ 温箱内 30 min。
3. 自来水洗,蒸馏水 1 min。
4. 用 0.5% 盐酸乙醇液分化,浸入自来水洗 1 min。
5. 蒸馏水洗,0.1% 亚甲蓝水溶液处理 1 min。
6. 蒸馏水 1 min,95% 乙醇快速分化。
7. 无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。
1. 石炭酸-复红液染色后,注意盐酸乙醇分化适中,必要时在显微镜下观察。
2. 亚甲蓝(美蓝)染色应浅些,便于对比清楚。
结果:抗酸杆菌呈红色,细胞核呈蓝色。
乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是由多肽组成的脂蛋白,由于抗原内含有丰富的二硫键成分,经过氧化剂而转变为磺酸,然后再与染色液产生较强的亲和力进行着色。通过地衣红(Orcein)染色法,能够较好地显示乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。
地衣红染色液:地衣红 1 g,70% 乙醇 95 ml,浓盐酸 5 ml。充分溶解后,调 pH 值为 1.2~1.6 即可。
酸性氧化液:高锰酸钾 0.5 g,盐酸 0.15 ml,蒸馏水 10 ml。
草酸溶液:草酸 2 g,蒸馏水 100 ml。
2. 酸性氧化液处理 5 min。
3. 自来水洗后用草酸溶液漂白 5 min。
4. 蒸馏水洗 3 次。
5. 浸入 70% 乙醇中 2 min。
6. 浸入地衣红染色液中 5~10 h(对新配制成的染色液,以及室温 15℃ 以下时还可适当延长时间)。
7. 直接用 95% 乙醇分化至阳性物质清晰为止。
8. 无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。
1. 酸性氧化液不能存放时间较长,防止失去氧化作用。
2. 地衣红染色用于肝穿刺时,必要时可用对照片(阳性)进行染色。
结果:乙型肝炎表面抗原阳性物质呈棕色。
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