标签: 灌注固定 神经生物学实用实验技术第二章第二节
来源:《神经生物学实用实验技术》第四军医大学出版社
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1灌注固定用1%戊巴比妥钠(80mg/kg)麻醉动物,沿胸骨柄剪开胸腔,剪开心包膜,暴露心脏,与心尖成30°-45°夹角剪开左心室,再剪开右心耳,将灌注针头从左心室插入主动脉,固定针头(图2-I),然灌注固定用1%戊巴比妥钠(80mg/kg)麻醉动物,沿胸骨柄剪开胸腔,剪开心包膜,暴露心脏,与心尖成30°-45°夹角剪开左心室,再剪开右心耳,将灌注针头从左心室插入主动脉,固定针头(图2-I),然后快速用生理盐水冲洗血液,再先快后慢注入固定液灌流固定1.5h(表2-2),如若固定的不理想可将材料取出后固定2-4h(4℃)
2取材动物经过灌注固定后须及时取材,组织所取部位、大小、形状根据实验需求遵循动作轻柔、避免挤压、切片平整、目的组织完整等原则。取出所需组织,放入20%蔗糖液中浸泡(4℃),直至组织完全脱水沉底。
(1)灌流要迅速,生理盐水不宜过多。固定液的灌注要先快后慢,以便充分固定。
(2)固定液总最通常为动物全身血液的2倍左右。
(3)浸泡固定时固定液体积是组织的20倍左右。
(4)取材需谨慎,勿撕扯组织,或用力过猛,造成组织损伤。
(5)戊巴比妥钠、苦味酸等试剂属于毒、麻药品,需专人管理。
其他试剂:①1%戊巴比妥钠溶液(100ml)称取戊巴比妥钠1g,生理盐水100ml,充分溶解(4℃放置);②0.1mol/L PB缓冲液(1000ml)分别称取KH2P04 13.6g,NaOH 3.20g,加双蒸水至1000ml,调pH至7.4; ③4%多聚甲醛溶液(1000ml)分别称取NaOH 3.20g,多聚甲醛40g,KH2P04 16.80g,蒸馏水溶解,过滤后定容,调pH至7.4(需用搅拌器搅拌,注意添加顺序,前一种完全溶解再加下一种,不需加热可迅速溶解);④多聚甲醛•戊二醛•苦味酸混合固定液;
(1)固定液的选择很重要,甲醇对抗原保存不理想,乙醇不适合用于T和B细胞抗原固定。
(2)灌流固定是做好免疫组化关键的第一步。生理盐水不宜过多,防止过多引起组织水肿,动物灌流固定结束后,应及时取材(2h内),避免长时间搁置。动物若灌流固定不好,可在取材后再后固定2-4h(4℃)。
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