原代培养来自于新生1-2d的SD大鼠皮层的少突胶质细胞。
依照总论的方法获得细胞悬液后,参考文献 (NatureProtocols,2007,2:I044-I051; Journalof Neuroscience Methods,2005,50-56) 介绍的方法,详细步骤如下。
1.在离心获得的细胞沉淀中,加入1.5ml的培养液并用小口径滴管轻柔重悬细胞,再用完全培养基(DMEM+10%胎牛血清+1mM的丙酮酸钠+4mM的谷氨酰胺+50U/ml青霉素)稀释,按照1.0x105/cm2的密度接种于多聚赖氨酸包被的T75的培养瓶中,混匀后放入37℃,5%CO2的孵育箱内培养。
2.接种2d之内尽量不要晃动培养瓶,培养4d后开始全量换液,以后每3d全量换液1次并注意镜下观察细胞融合度。
3培养至第7-9天时,星形胶质细胞已铺满瓶底,并且可见其上层有胞体小、折光高、有小突起的少突前体细胞出现,此时可以开始纯化细胞。
4先用摇床除去处于半悬浮生长的小胶质细胞(200r/min,37℃,约20min),然后快速全拯换液。
5换液过夜稳定后继续用摇床分离少突前体细胞(280r/min,37℃),18-20h后收集细胞悬液并使其通过200目的细胞筛网,然后再利用差速贴壁除去混入的星形胶质细胞和小胶质细胞(将过滤的细胞悬液接种于100mm培养皿[Corning, NY]内静置,每隔5min用手轻轻摇晃1次,连续持续30min),剩余培养瓶中的细胞可以加新鲜完全培养液继续培养3d,然后重复5的步骤。
6.收集培养皿中的细胞上清并计数,离心(1000r/min,5min)后弃上清,以少突前体细胞增殖培养基(无血清培养基Satomedium中添加10ng/ml PDGF-AA和10ng/ml bFGF)重悬细胞,并按照(3-4)x104/cm2密度接种于多聚鸟氨酸包被的培养皿或玻片上,每天补充半量的增殖因子(PDGF-AA和bFGF)
7. 2-3d后细胞增殖至铺满培养皿时可用消化分离培养液(DMEM/F12中添加0.01%EDTA、0.2mg/ml DNase I溶液、5µg/ml胰岛素)消化细胞(直接吸弃培养液并加入少量消化液,手心中摇晃5-8min),利用含血清培养液终止消化,仔细吹打培养皿底部,使全部细胞脱落,然后收集细胞上清离心。
8.传代1次的细胞可以继续接种于增殖培养基中,也可以接种千分化培养基内[无血清培养基Satomedium中添加15nM三碟甲腺原氨酸(T3)、10ng/ml CNTF和5µg/ml NAC]开始诱导少突胶质细胞分化。此后每隔Id补充半量的促分化因子(T3、CNTF和NAC),在分化培养基中培养2d后可以获得未成熟的少突胶质细胞,在培养6d后可以获得成熟的少突胶质细胞。无血清培养基Satomedium制备:在DMEM/F12中添加4mM谷氨酸、0.1mM丙酮酸钠、0.1%BSA、50µg/ml转铁蛋白、5µg/ml胰岛素、30nM硒酸钠、10nM维生素H和10nM氢化考的松。少突胶质细胞的细胞体较星形胶质细胞和小胶质细胞的小,少突前体细胞的为双极突起,随着分化成熟,突起分支增多,呈蛛网状(图I-4)。在少突胶质细胞分化成熟过程中特异性表达一系列的标记物,从而可以根据不同的标记物鉴别少突胶质细胞及所处的分化阶段
|