标签: D-6-葡萄糖 己糖激酶 酶学实验手册第三章
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直接测量己糖激酶的反应:
D-葡萄糖+ATP → 6-磷酸葡萄糖+ADP
简单的光度测量是达不到的,葡萄糖的磷酸化最好用测量磷酸或者 ATP32 标记的办法。由于通过层析,G6P 的实验必须完全与 ATP 和 ADP 分开,因此,建议应用 HPLC 方法。酶的实验通常是酶与 G6P 脱氢酶反应偶联:
D-6-葡萄糖+ATP+NADP+ → 6-磷酸葡萄糖+ADP+NADPH+H+
这些反应都已经通过光度测量实现。当使用这个偶联的系统,首先应该单独进行 G6P 反应实验,然后在己糖激酶的存在下用葡萄糖和 ATP 取代 G6P 继续反应。
0.98 ml 实验混合物
0.02 ml 酶样品
25℃ 时,于 340 nm 处吸收值升高,ε340=6.3×103 l/(mol·cm)。
试剂:
100 mmol/L 三乙醇胺-HCl/NaOH,pH 7.6(三乙醇胺-HCl,用 1 mol/L NaOH 调节)
1.0 mol/L D-葡萄糖(Mr=180.2;18 g/100 ml)
0.1 mol/L ATP(二钠盐,三水合物,Mr=605.2;605 mg 溶于 10 ml 水)
0.1 mol/L MgCl2(六水合物,Mr=203.3;203 mg 溶于 10 ml 水中)
0.01 mol/L NADP(二钠盐,Mr=787.4;79 mg 溶于 10 ml 水中)
6-磷酸葡萄糖脱氢酶(商业品有 100~500 U/mg,准备时稀释至大约 5U/0.1 ml)
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