标签: 结缔组织染色 免疫组织化学实验技术及应用 第十五章
结缔组织广泛分布于入体和动物体内,而疏松结缔组织在组织损伤后的修复过程中,纤维细胞可转化为活跃的成纤维细胞。成纤维细胞能形成胶原纤维、弹力纤维和网状纤维以及基质等成分。致密结缔组织的间质内含有大量纤维,排列紧密,细胞和基质比较少,主要含有弹性纤维,又称为弹性致密结缔组织。网状结缔组织由网状细胞和网状纤维组成,其化学成分含有蛋白质和多糖。通过染色试剂,能够证明结缔组织纤维分类和纤维之间存在的相互关系。内容来源:《免疫组织化学实验技术及应用》
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胶原纤维是由胶原蛋白聚合与缠绕嫘旋排列而成的,具有双折光性,经过特殊染色后,能够在偏光显微镜下观察到四种不同型的胶原纤维。由于胶原纤维分子中含有碱性氨基酸,能够与酸性染料进行结合反应。常用丽春红-苦味酸(2,4,6-三硝基苯酚)染色法。
丽春红-苦味酸染色液:0.5% 丽春红 S(Ponceau S)水溶液 12 ml,苦味酸饱和液 88 ml。
1. 石蜡组织切片,常规脱蜡至水。
2. 丽春红-苦味酸染色液染色 5 min。
3. 直接用无水乙醇分化与脱水。
4. 用过滤纸吸干。
5. 二甲苯透明和中性树胶封固。
1. 丽春红-苦味酸混合液可室温存放,使用滴染方法。
2. 无水乙醇脱水时,应将切片斜放,减少多余水分。
结果:胶原纤维呈红色,背景呈黄色。
网状纤维是网状结缔组织中的一种纤维,由交错排列的纤细的纤维组成。由于网状纤维由含有糖蛋白的胶原蛋白组成,这种组织蛋白质易与氨性银结合,再选用酸性染料染色液,能够显示网状纤维与胶原纤维的二种组织结构成分。常用 Gomori 银与丽春红-苦味酸复合染色法。
氨性银溶液
甲液:硝酸银 10.2 g,蒸馏水 100 ml。
乙液:氢氧化钠 3.1 g,蒸馏水 100 ml。
取甲液 5 ml,滴加氨水至溶解清亮为止。再加入 5 ml 乙液,此时溶液突然变为黑色,再滴加氨水至清亮为止。补加 4 滴氨水,用蒸馏水补足 50 ml。
高锰酸钾氧化液:高锰酸钾 0.5 g,蒸馏水 95 ml,3% 硫酸 5 ml。
草酸漂白液:草酸 2 g,蒸馏水 98 ml。
硫酸铁铵液:硫酸铁铵 2 g,蒸馏水 98 ml。
2. 高锰酸钾氧化液处理 5 min,自来水洗 1 min。
3. 草酸漂白液浸泡 2 min,自来水 1 min。
4. 硫酸铁铵液处理 2 min,自来水洗 2 次。
5. 蒸馏水洗 2 次,氨性银溶液处理 1 min。
6. 蒸馏水洗 2 次,20% 甲醛液还原 3 min。
7. 蒸馏水洗 2 次,0.2% 氯化金处理 1 min。
8. 蒸馏水洗 2 次,丽春红-苦味酸染色液处理 3 min。
9. 无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。
1. 配制氨性银溶液必须使用干净器皿,放在冰箱内保存,可用较长时间。
2. 高锰酸钾氧化液存放时间不能过长,以免失去氧化效果。
3. 氨性银染色后,不能将银液倾去,要将蒸馏水直接倒在组织切片上轻洗。
结果:网状纤维呈黑色,胶原纤维呈红色,背景呈黄色。
弹力纤维由随机交联盘绕的一些肽链组成,含有丰富的二硫键糖蛋白成分,所以可称为弹性蛋白。易与染色液中碱基结合,为了能够更好地显示弹力纤维和胶原纤维成分,选用维多利亚蓝、丽春红和苦味酸组合双重染色方法。
2. 切片入 70% 乙醇中洗 2 min。
3. 将切片浸入盛有维多利亚蓝液中染 2~5 h。
4. 直接入 95% 乙醇中分色数秒钟。
5. 用蒸馏水洗 2 min。
6. 用丽春红-苦味酸染色液滴染切片 3 min。
7. 直接用无水乙醇冲洗多余染色液 2 次。
8. 二甲苯透明和中性树胶封固。
1. 维多利亚蓝染色液可在室温中存放较长时间,染色液浸染后倒回原处,可反复使用。
2. 95% 乙醇分色后,立即浸入水中,可用显微镜观察染色程度,如果较浅或较深,可再重复染色或分色。
结果:弹力纤维呈蓝绿色,胶原纤维呈红色,背景呈黄色。
结缔组织中含有大量的细胞间质纤维和基质组分,主要成分为蛋白和多糖,常用 Masson 染色方法。
Masson 染色液:酸性复红 1 g,丽春红 1 g,橘黄 G 2 g,0.5% 乙酸 100 ml。
亮绿染色液:亮绿 0.5 g,冰醋酸 1 ml,蒸馏水 100 ml。
冰醋酸水溶液:冰醋酸 0.5 ml,蒸馏水 100 ml。
磷钼酸水溶液:磷钼酸 2 g,蒸馏水 100 ml。
2. Masson 染色液染色 3 min,冰醋酸水溶液处理 1 min。
3. 蒸馏水洗 2 次,磷钼酸水溶液处理 2 min。
4. 蒸馏水洗 2 次,亮绿染色液染色 1 min。
5. 蒸馏水洗 2 次,冰醋酸水溶液处理 30s。
6. 无水乙醇脱水,二甲苯透明和中性树胶封固。
1. Masson 染色液作用时要保持组织染上适景红色,必要时显微镜下观察。
2. 亮绿染色液处理时间的长短可根据不同的组织而定。
结果:肌纤维呈红色,结缔组织纤维呈绿色,红细胞呈黄色,背景无色。
黏蛋白是多糖与蛋白质结合的复合物,组织内含有硫酸根等成分,带有酸性物质,可称为酸性黏液(黏蛋白)。弹力纤维中的弹性蛋白由一种凝胶状的肽链组成,通过非极性吸附显色。胶原纤维是由纤维母细胞产生的一种胶原蛋白铰链而成,易与酸性染料结合。经过组合染色后,可分别显示胶原蛋白、弹力蛋白和黏蛋白成分。
阿尔辛蓝染色液:阿尔辛蓝(Alcian blue 8 GS,由上海试剂三厂生产)1 g,冰醋酸 3 ml,蒸馏水 97 ml。
间苯二酚-复红染色液:间苯二酚 2 g,碱性复红 2 g,蒸馏水 400 ml,30% 三氯化铁 3 ml,盐酸 2 ml。先将间苯二酚、复红和蒸馏水混合搅拌均匀,煮沸后加入三氯化铁,再煮沸搅拌 3~5 min,冷却后过滤。将滤纸上的沉淀物一起放在隔水式恒温箱中烤干,取出放入烧杯中,并加入 95% 乙醇 200 mU 放在水浴锅内加热搅拌溶解,取出滤纸,盛于棕色试剂瓶内,再补 20 ml 的 95% 乙醇,最后加入盐酸 4 ml,混合使用,室温下保存。
2. 95% 乙醇浸洗 2 次,浸入间苯二酚-复红染色液内 1 h 左右。
3. 直接用 95% 乙醇快速分化 2 次,浸入蒸馏水内 1 min。
4. 阿尔辛蓝染色液染色 15 min,蒸馏水洗 2 次。
5. 用 3% 乙酸液浸泡 1 min,蒸馏水洗 2 次。
6. 滴染丽春红-苦味酸染色液 3 min。
7. 无水乙醇脱水、二甲苯透明和中性树胶封固。
1. 间苯二酚-复红染色液装入试剂瓶中,将瓶口塞紧,放在冰箱内保存。
2. 丽春红-苦味酸染色后,迅速脱水、过滤纸吸干,透明和封固。
结果:黏蛋白呈绿色,弹力蛋白呈紫色,胶原蛋白呈红色,背景呈淡黄色。
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