标签: L-乳酸脱氢酶 L-乳酸 酶学实验手册第三章
本实验主要用于测定L-乳酸脱氢酶的活性。
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乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)广泛存在于生物细胞内,是糖代谢酵解途径的关键酶之一。LDH可溶于水或稀盐溶液。组织中LDH含量测定方法很多,其中紫外分光光度法更为简单、快速。鉴于NADH,NAD+在340nm及260nm处有各自的最大吸收峰,因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值的改变,定量测定酶的含量。
一、试剂:
0.1 mol/l 磷酸钾 pH 7.0
0.01 mol/l NADH(71 mg 溶于10 ml H2O 中)
0.1mol/l 丙酮酸(丙酮酸钠,Mr=110;110 mg溶于10 ml H2O 中)。
LDH 原料溶液(从猪心脏提取,例如 10 mg/ml,用 0.1 mol/l 磷酸钾 pH 7.0 稀释至 1 IU/ml)
二、LDH活力测定
1. 取1只比色杯中加入0.1 m mol/L pH7.5 磷酸氢二钾缓冲液3ml,置于紫外分光光度计中,在340nm处将光吸收调节至零。
2. 取1只比色杯,依次加入丙酮酸钠溶液2.9ml,NADH溶液0.1ml,加盖摇匀后,加入经稀释的酶液10μl,加盖摇匀后,在A340nm,连续测定3min,以A对时间作图,取反应最初线性部分,计算A340nm/min减少值。
三、数据处理
计算每毫升组织提取液中LDH活力单位。
实验所需「试剂」具体见「其他」
1.98 ml 实验混合物
0.02 ml LDH 稀释溶液
25℃ 时,在 260 nm 激发,470 nm 处测定每分钟荧光差异。用适当浓度范围的 NADH 浓度对荧光强度的标准曲线来确定比例因子。
计算
体积活性:
特殊活性:
试剂:
0.98 ml 实验混合物
25℃ 时,于 340 nm 处吸收值降低。NADPH 的吸收系数 ε340=6.3×103 l/(mol·cm)。
0.01 mol/l NADH(0.663 g 溶于10 ml 0.1 mol/l 磷酸钾,pH 7.5)
0.5 mol/l 乳酸(乳酸钠,Mr=112;560 mg 溶于10 ml 0.1 mol/l 磷酸钾,pH 7.6)
LDH 原料溶液(从猪心脏提取,如 550 IU/ml,例如10 mg/ml,用0.1 mol/l 磷酸钾 pH 7.0 稀释至 1 IU/ml)
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