标签: 抗原决定簇标记 多亚基蛋白复合体 哺乳动物细胞 表达纯化 精编分子生物学实验指南第五版第十六章
哺乳动物蛋白质的生化分析和功能研究常因为得不到纯化的蛋白质而受阻,尤其是当所研究的功能实体在细胞内是多亚基蛋白复合体的时候。为了克服从哺乳动物细胞中纯化多亚基蛋白复合体的困难,可以制作包含抗原决定簇标记蛋白的稳定转染细胞系。由于抗原表位标记的蛋白质在细胞内可以以不同的复合物形式存在,因此,分离不同形式的多亚基蛋白复合物也很重要。本实验介绍四种。内容来源于《精编分子生物学实验指南(第五版)》
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实验方法原理 | 首先通过逆转录病毒介导的转基因(用于组成型表达)或四环素调控的系统(用于可诱导表达)建立表达抗原决定簇标记的蛋白复合体亚基的稳定细胞系。然后用抗原决定簇特异的单克隆抗体偶联的小珠进行免疫亲和纯化,以沉降抗原决定簇标记的多亚基蛋白复合体。最后在中性 pH 或生理条件下洗脱回收,即可用于功能试验。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. 将 FLAG 标记蛋白编码序列克隆到含有药物筛选标记(如新霉素)的逆转录病毒载体。 2. 转移 20 μg 到 5 ml 圆底 Falcon 试管中并与 0.5 ml 2 × HeBS,pH 7.12 混合。 3. 逐滴加入 0.5 ml 0.25 mol/L CaCl2 同时涡旋混匀。室温放置 20~30 min。 4. 激烈涡旋混匀 DNA-磷酸钙共沉降物,将混合物加入 50% 汇片的 ψ CRIP 细胞,这些细胞用含 10% 小牛血清的 DMEM 培养在 100 mm 组织培养皿中。37℃,5% CO2 培养 3 ~4 h。 5. 移出培养基加入 3 ml 15%(V/V)甘油/DMEM,室温放置 3 min。 6. 加入 8 ml DMEM 以快速稀释甘油,混匀,然后移出溶液。 7. 重复洗涤 3 次,每次用 3 ml DMEM。 8. 加入 10 ml 含 10% 小牛血清的 DMEM 至转染了的细胞,37℃、5% CO2 培养 18 h。 9. 用 0.45 μm 醋酸纤维素注射滤器过滤细胞培养上清液(甘油休克 18 h 后)以去除悬浮细胞和大的细胞碎片,将病毒颗粒收集于 15 ml 无菌试管。 10. 用 1 ml 含 10% FBS 的 DMEM 和聚凝胺(终浓度为 8 μg/ml)与 1 ml 过滤后的病毒储液混合。混合物与 50% 汇片的 HeLa 细胞在 37℃ 共孵育 2.5 h,间歇混合。这些细胞用含 10% FBS 的 DMEM 培养于 100 mm 细胞培养皿中,并且用培养基预洗了 2 次。 11. 额外加入 8 ml 含 10% FBS 的 DMEM,不要移除起初转染的培养基,37℃ ,5% CO2 培养 1~1.5 天。 12. 分出 1/5 的细胞到含有药物的培养基,每 3~4 天更换选择培养基。抗性克隆通常 2~3 周后可见。 13 . 准备一个 24 孔板,隔一个孔加入 2 滴(约 100 μl)胰酶-EDTA 以避免相邻孔之间的交叉污染。 14. 用黑色(或蓝色)记号笔把将要挑出的药物抗性克隆用圆圈圈出(直径为 2~3 mm)。移除培养基,用 1 × PBS 洗涤细胞 1 次,然后移除溶液。 15. 用 200 μl 吸头从第一个孔取约 50 μl 胰酶-EDTA,在圆圈圈住的克隆处吸打数次后转移回第一个孔。 16. 重复转移总共 12 个克隆。 17. 每一孔加入 1~2 ml 选择培养基。将 24 孔细胞培养板放回 37℃,5% CO2 培养箱使细胞贴壁生长。基于转移的活细胞数,孔内细胞汇片可能需要 3~14 天。 18. 当 24 孔板中的细胞汇片时将其转移至一个 60 mm 的细胞培养皿中以继续单个细胞克隆的扩增。 19. 当细胞在 60 mm 细胞培养皿中接近汇片的时候,再次将细胞分到一个 60 mm 细胞培养皿和两个 100 mm 细胞培养皿中。在 100 μl 细胞培养皿中培养的细胞将要冻存为单独的克隆化细胞系。 20. 在用 1 × PBS 洗涤 2 次过后,加入 300 μl 1 × SDS 聚丙烯酰胺蛋白上样缓冲液至生长在 60 mm 细胞培养皿中达到 80%~90% 汇片的细胞中,以制备总细胞裂解液。用枪头多次吸打裂解液直到样品没有黏性,然后将样品转移至 1.5 ml 微量离心管中。 21. 用抗 FLAG M2 单克隆抗体和(或)抗蛋白抗体对每个收集到的总细胞裂解液进行免疫印迹以鉴定表达 FLAG 标记蛋白的细胞克隆。 22. 通过调整至悬浮培养的方法,选择一个表达 FLAG 标记蛋白的阳性克隆做进一步扩增。合并 12 中 100 mm 细胞培养皿的细胞至一个 250 ml 旋转摇瓶中,用含 10% FBS 的 Joklik 培养基将细胞密度调整至 0.5 × 106 细胞/ml。使细胞以同样的密度在含 10% FBS 的 Joklik 培养基中保持 3 天以上。如果细胞健康并且接近指数增长,则开始用含 10% 小牛血清的 Joklik 培养基培养细胞。继续用含 10% 小牛血清的 Joklik 培养基培养细胞至少 3 天。如果细胞仍然看起来健康并且生长旺盛,则开始用含 7.5%(或 5%)小牛血清的 Joklik 培养基培养细胞。 在扩增和血清转换/减少的过程中,如果细胞看起来不健康或细胞密度减少,将细胞 300 g 离心 5 min,用含相同浓度小牛血清的新鲜知 Joklik 培养基重悬,这能帮助去除细胞碎片。重新调整细胞密度至 0.5×106 细胞/ml。一旦细胞健康且继续生长就开始按前述方法降低血清的浓度。重复这个过程直到细胞维持于含 5% 小牛血清的 Joklik 培养基中。 23. 连续培养和扩增生长在含 5% 小牛血清的 Joklik 培养基中的细胞至 20 L 或其他想要的体积。 24. 按照 12.1制备核抽提物、细胞质 S100 和核丸(或染色体组分)。 25. 用免疫印迹来识别包含 FLAG 标记蛋白的细胞组分。 26. 加入 0.4 ml 抗 FLAG M 2 的单克隆抗体偶联的小珠至装有 10~14 ml 核抽提物(或 S100,或溶解了的核丸)的 15 ml 试管,这些小珠预先用 BC100 洗涤几次。在一个试管旋转仪中将样品于 4℃ 孵育 6~12 h。 27. 4℃ 300 g 离心 1 min,将上清和小珠分离。 28. 弃上清,用 BC300/0.1% 诺乃洗涤剂 P-40 洗涤绑定着蛋白质的小珠 5 次。 包含诺乃洗涤剂 P-40 防止蛋白质/小珠聚集,也有助于在洗脱过程中免疫亲和小珠更好地旋转。 29. 转移带有绑定蛋白质的 M2 偶联的小珠至一个微量离心柱中。 30. 最高速度(10000 r/min)离心 10 s 以去除残留液体。 31. 加 0.5 ml BC300/0.1% 诺乃洗涤剂 P-40 及 0.2 mg/ml FLAG 肽至干燥的小珠。充分混匀,4℃ 连续旋转孵育 20~60 min。 32. 4℃ 离心 10 s 收集洗脱液(也就是第一次洗脱)。 33. 重复洗脱(步骤 31 和 32)(总共)4 次以得到绝大部分的 FLAG 标记的蛋白复合体。 34. 分装样品成小份(如 20 μl) 于 0.5 ml 微量离心管,然后用液氮速冻。将纯化了的复合体小份储存于 -80℃ 直到使用。 |
注意事项 | 通常对 HeLa 细胞所使用的药物浓度依赖于单个药物筛选标记,分别是:G418(总重)为 1 mg/ml,潮霉素为 0.2 mg/ml 或 0.5 μg/ml 嘌呤霉素。额外细节见转染哺乳动物细胞选择实验。 |
其他 |
实验方法原理 |
有时导入的 FLAG 标记蛋白编码序列在逆转录病毒介导的转基因和药物筛选建立的克隆化细胞系中不表达。这可能是由于外源基因产物没有被调控的或组成型表达所造成的细胞毒性。为了克服这个问题,基于四环素的使用,一个可诱导的哺乳动物表达系统可以用来“打开”或“关闭” FLAG 标记蛋白的表达。在建立表达 FLAG 标记蛋白细胞系的过程中,持续加人四环素以沉默外源基因表达。进而用存在和不存在四环素时收集的总细胞裂解液进行免疫印迹来筛选单个细胞克隆的可诱导性。一旦鉴定出来,就把可诱导的细胞系调整至适应悬浮培养,去除四环素后,用于 FLAG 标记多亚基蛋白复合体的免疫亲和纯化。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. 将蛋白编码序列克隆到一个含有 FLAG 抗原序列的四环素调控表达的质粒中,如 pTetCMV-F°(S)。 2. 混合 10 μg 线性化的四环素调控的 FLAG 标记蛋白表达质粒 [如使用 PvuI 来线性化大多数 pTetCMV - F°(S)衍生构建物] ,50 μg 剪切过的小牛胸腺 DNA 和 0.5 μg SacI 线性化、含有潮霉素筛选标记的 pREP4 至电穿孔杯。 3. 胰酶-EDTA 处理后合并几个 100 mm 细胞培养皿的 HtTA-1 细胞(或其他表达四环素调控的反式激活因子的细胞)至一个 50 ml Falcon 试管,这些细胞培养在含 10% FBS 0.6 mg/ml G418 的 DMEM 中。300 g 离心 5 min,重悬细胞于含 10% FBS 和 5 mmol/L BES 缓冲液 pH 7.2 的 DMEM 中,密度为 2 × 107 细胞/ml。 4. 用一个 200 μl 吸头分 2 次,每次 125 μl,将 250 μl 重悬细胞转移至装有质粒和载体 DNA 的电穿孔杯中(见步骤 2),吸打数次混匀。 5. 用 Bio-Rad Gene Pulser II 将 DNA 穿孔进入细胞,设置为 960 μF 和 200 V。室温放置 10 min,然后用一个一次性玻璃吸头将细胞转移至一个装有 10 ml 含 10% FBS 的 DMEM 的离心管里。 6. 300 g 离心 5 min。吸弃上清,其中含有未被转化的 DNA 和电穿孔产生的细胞碎片。 7. 重悬细胞于 5 ml 含 10 % FBS 的 DMEM, 分布于 5 个 100 ml 细胞培养盘,每个装有 9 ml 含 10% FBS 的 DMEM,37℃ 5% CO2 培养箱放置 2 天。 8. 药物筛选从把培养基换成含有 400 μg/ml G 418、200 μg/ml 潮霉素 B 和 2 μg/ml 四环素、10% FBS 的 DMEM 开始。 9. 每 3~4 天换一次培养基,继续药物筛选约 3 个星期直到药物抗性克隆清晰可见。 10. 按照基本方案 1 步骤 13~18,挑 12~24 个药物抗性克隆并将其扩增成为细胞系。 11. 当在 60 mm 细胞培养皿的细胞接近汇片时,将细胞分至一个 100 mm 细胞培养皿和两个 60 mm 细胞培养皿。 生长在 100 mm 细胞培养皿的细胞将要作为单独的细胞系冻存。生长在两个 60 mm 细胞培养皿的细胞分别放入含有和不含有四环素的选择培养基中培养 48~72 h。 12. 在用 1 × PBS 洗涤 2 次过后加入 300 μl 1 × SDS 聚丙烯酰胺蛋白上样缓冲液至生长在 60 mm 细胞培养皿中的细胞中,以制备总细胞裂解液。用枪头多次吸打裂解液直到样品没有黏性,然后将样品转移至 1.5 ml 微量离心管中。 13. 用抗 FLAG M2 单克隆抗体和(或)抗蛋白抗体对每个收集到的总细胞裂解液的一小份进行免疫印迹以鉴定仅在无四环素时表达 FLAG 标记蛋白的细胞克隆。 14. 选择一个表达 FLAG 标记蛋白的阳性克隆,通过调整至悬浮培养的方法做进一步扩增。合并 12 个 100 mm 细胞培养皿的细胞至一个 250 ml 旋转摇瓶中(细胞密度至 0.5 × 106 细胞/ml),渐渐将培养基从 DMEM 10% FBS 替换成含 10 % 小牛血清的 Joklik 培养基,最终至含 5% 小牛血清的 Joklik 培养基。但是在扩增过程中培养基中包含 1 μg/ml 四环素和 0.6 mg/ml G418 直到培养体积达到 250 ml。 15. 继续在含有四环素的培养基中扩增细胞,但是培养体积达到 250 ml 以后不用 G 418。 16. 在细胞扩增到 12 L 后,在 250 ml 无菌锥形试管中 300 g 离心 5 min 去除四环素。重复操作直到所有细胞收集到两个 250 ml 锥形试管中。 17. 用 250 ml 1 × PBS 洗涤细胞团聚物。300 g 离心 5 min。重复洗涤 4~6 次。 18. 重悬细胞于 120 ml 无四环素的 5% 小牛血清 Joklik 培养基中,将细胞分至 6 个装有 1.5 L 含 5% 小牛血清 Joklik 培养基的 12 L 瓶中。 19. 蛋白质诱导 4 天后,每天培养基增加一倍,按照 12.1 制备核抽提物、细胞质 S100 和核丸(或染色体组分)。 20. 用免疫印迹来鉴定含有 FLAG 标记蛋白的细胞组分。 21 . 按照「组成型 FLAG 标记」步骤 26 ~34 描述的方法, 对 FLAG 标记蛋白复合体免疫亲和纯化。 |
注意事项 | 诱导蛋白表达在悬浮细胞中往往比单层细胞中耗时更多。时间进程研究的结果表明,4 天后诱导的 FLAG 标记蛋白达到最大量,一定程度上是由于在大体积的悬浮培养基中使用便宜和低浓度的小牛血清可以减少倍增时间。每天培养基加倍使细胞处于轻微稀释的条件下,诱导效率更高。 |
其他 |
实验方法原理 | 本方案以人 RNA 聚合酶 II(Pol II)为例,描述抗原表位标记蛋白的纯化。RNA 聚合酶 II 是一个具有 12 个多肽(RPB1-12)的多亚基蛋白复合体。Pol II 最大的亚基(RPBl)具有一个唯一的七肽序列 Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser(YSPTSPS)的 C 端结构域(CTD)。这个序列在酵母中出现 26 次,人中出现 52 次。这个 CTD 可以被很多蛋白激酶磷酸化,造成通常在真核生物中存在的 Pol II 有三种形式。IIO 型的 Pol II 含有高度磷酸化的 CTD,而 IIA 型 Pol II 具有无或低磷酸化的 CTD。IIB 型的 Pol II 没有 CTD,可能是由蛋白酶切割产生。另外,通过与一些通用转录因子和其他与染色质重塑、mRNA 加工和 DNA 修复相关的胞内蛋白结合,Pol II 能够形成极大的蛋白复合体,即所谓的 Pol II 全酶。这个备择方案以应用抗原表位标记和稳定细胞系的方法同时纯化 IIO、IIA 和 IIB 型的 Pol II 以及只有非磷酸化形式的 RPB1 的 Pol II 全酶。通过谨慎选择起始材料和调整用于免疫亲和纯化的蛋白缓冲液的组成就能达到纯化的目的。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. 纯化 FLAG 标记的人 pol II 全酶: 1.1 建立一个 HeLa 细胞衍生的、四环素调控的、条件性表达 FLAG 标记的人 pol II 亚基的细胞系。按照「条件性表达 FLAG 标记」步骤 1~20 描述的方法制备核抽提物、细胞质 S100 和核丸。 1.2 从核抽提物或 S100 中免疫亲和纯化 FLAG 标记的人 pol II 全酶,按照「组成型表达 FLAG 标记」步骤 26~34,但使用 BC100/1%(V/V)诺乃洗涤剂 P-40 作为洗涤和洗脱缓冲液。 2. 纯化 IIA 型 FLAG 标记的人 pol II: 2.1 从核抽提物或 S100 中免疫亲和纯化 FLAG 标记的人 pol II,按照基本方案 1 步骤 26~34,除了用含 1.0mol/L 尿素的 BC850/0.1% 诺乃洗涤剂 P-40 和 BC100 依次洗涤绑定蛋白的小珠 5 次,最后用含 0.2 mg/mlFLAG 肽的 BC100(FLAG 肽洗脱缓冲液)洗脱绑定的蛋白质。 含有高盐和尿素的洗涤破坏了 pol II 全酶中弱结合的多肽与 pol II 的作用,从而使得仅能回收 IIA 型的核心 pol II。核心 pol II 形成紧密结合的复合体能耐受髙盐和尿素洗脱。 3. 纯化 FLAG 标记的包含 IIA、IIB 和 IIO 型混合的人 pol II: 3.1 在 4℃ 下或冰上用 70 ml 缓冲液 B,缓慢搅动 35 ml 从 hRPB9-3 细胞分离得到的核丸,然后用 11 ml3mol/L 硫酸铵调整硫酸铵浓度至 0.3mol/L。再搅动 30 min。hRPB9-3 是一个衍生于人 HeLa 细胞、条件性表达 FLAG 标记的人 RNA 聚合酶 II RPB9 亚基的细胞系。 缓冲液 B 与硫酸铵一起使用,其中镁离子和高盐浓度可以帮助从染色体组分解离 pol II 复合体,并同时保持 pol II 的活性。 3.2 超声 5 次,在冰水浴中每次 1 min,每两次超声之间间隔 20 s。 3.3 4℃ 185000 g 离心 90 min(Beckman45-Ti 转子 40000r/min),将上清倒入一个 500 ml 烧杯。 3.4 用一个注射器逐滴加入 2 体积缓冲液 B,逐渐将硫酸铵浓度调整至 0.1mol/L。 3.5 185000 g 离心 60 min 去除沉降物,将上清倒入另外一个烧杯。 3.6 缓慢加入固体硫酸铵至 65% 饱和(即 0.42 g/ml 悬浮液),沉降 pol II,再搅拌 30 min. 3.7 142000 g 离心 60 min,用 40 ml 缓冲液 D 重悬沉淀。 3.8 在 4 L BC100 中透析 6 h,至少换一次缓冲液。最终回收的样品是约 46 ml。 3.9 免疫亲和纯化 FLAG 标记的包含 IIA、IIB 和 IIO 型混合的入 pol II 按照基本方案 1 步骤 26~34,在最后用含 0.2 mg/ml FLAG 肽的 BC100(FLAG 肽洗脱缓冲液)洗脱之前用含 1.0mol/L 尿素的 BC850/0.1% 诺乃洗涤剂 P-40 和 BC100 依次洗涤绑定蛋白的小珠 5 次。 含有高盐和尿素的洗涤破坏了 pol II 全酶中弱结合的多肽与 pol II 的作用,从而使得只能回收含有不同磷酸化状态的核心 pol IIO 在最终用 FLAG 肽 BC100 洗脱缓冲液洗脱之前有必要用 BC100 平衡固化了的复合体。 |
注意事项 | |
其他 |
实验方法原理 | 人 TATA 结合蛋白(TBP)能够结合不同类型的细胞内蛋白以形成不同的蛋白复合体,如 SL1、TFIID 和 TFIIIB。这些蛋白质分别是通过 RNA 聚合酶 I、II 和 III 的转录所必要的。所有这些不同的蛋白复合体在核抽提物中都能找到。用一个层析步骤,如 P11 离子交换柱,把含 TBP 的不同的复合体分离成为不同组分,然后进行免疫亲和纯化。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. 用逆转录病毒介导的转基因建立一个 HeLa 细胞衍生的表达 FLAG 标记的人 TBP 的细胞系,并且按照基本方案 1 步骤 1~24,从建立的细胞系中制备核抽提物、S100 和核团块。 2. 在一个层析柱中装一个约含 60 ml 树脂的 P11 离子交换柱。 3. 将柱连到一个流体适配器、图表记录器和样品收集器上,用 BC100 平衡整个系统过夜。流速设置为每小时约 1 个柱体积(CV),即 1 ml/min。 4. 4℃ 时在一个冰桶中融化约 100 ml 核抽提物过夜。 5. 4℃ 时将核抽提物 105000 g 离心 20 min。 6. 上清倒入 50 ml 试管以 1 CV/h 的流速上样至已平衡的 P11 柱。用样品收集器收集洗出物,约 12 ml 每管。 记住保留一小份(约 100μl)进行免疫印迹分析。 7. 用约 2 CV 的 BC100 洗涤柱子直到在 280 nm 的吸收值几乎达到基线。 8. 当每种洗脱缓冲液的蛋白质曲线几乎接近基线时,相继转换到 BC300、BC500、BC850 和 BC1200 进一步洗脱结合蛋白。 9. 混合对应 BC100、BC300、BC500 和 BC850 蛋白峰的组分。 10. 将 BC500 和 BC850 样品在 4L BC100 中 4℃ 透析 5 h。 11. 将样品 46000 g 4℃ 离心 15 min。 12. 将 BC500 和 BC850 的上清,以及 BC100 和 BC300 组分,单独地分装到几个 15 ml 试管(做免疫亲和纯化)和 1.5 ml 微量离心管(做免疫印迹和蛋白质分析)。 13. 液氮冷冻,存放于 -80℃ 直到使用。 14. 用免疫印迹来定位包含 FLAG 标记 TBP 的 P11 组分。 15. 按照「组成型表达 FLAG 标记」 步骤 26~34,从 P11 0.3mol/L 氯化钾组分纯化 TFIIIB 以及从 P11 0.85mol/L 氯化钾组分纯化 TFIID。 |
注意事项 | |
其他 |
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