1. 0.2 mol/L 的 pH6.0 磷酸缓冲液的配制 准确称取 KH2PO4 0.8 g 和 K2HPO4 0.2 g,置 100 ml 容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,灭菌备用。
2. 标准青霉素溶液的配制 精确称取 15-20 mg 氨苄青霉素标准品,每毫克含 1667 单位(1 667 U/mg, 1 U 即 1 国际单位,等于 0.6 μg),溶解在适量的 0.2 mol/L 的 pH 6.0 磷酸缓冲液中,然后稀释成 10 U/ml 的青霉素标准溶液,按表 IX-2 配制成不同浓度的青霉素溶液,保存于 5℃ 备用。
3. 青霉素发酵液样品溶液的制备 用 0.2 mol/L 的 pH 6.0 磷酸缓冲液将青霉素发酵液适当稀释,备用。
4. 金黄色葡萄球菌菌液的制备 取用培养基 I 斜面保存的金黄色葡萄球菌菌种,将其接种于培养基 II 斜面试管上,于 37℃ 培养 18~20 h,连续传种 3~4 次,用 0.85% 的生理盐水洗下,离心后,菌体用生理盐水洗涤 1~2 次,再将其稀释至一定浓度(约 109 / ml, 或用光电比色计测定,在波长 650 nm 处;透光率为 20% 左右即可)。
5. 抗生素扩散平板的制备 取灭菌过的平皿 18 个。分别加入已融化的培养基 I 20 ml,摇匀,水平位置使其凝固,作为底层。另取培养基 II 融化后冷却至 48~50 ℃,加入适量上述金黄色葡萄球菌菌液,迅速摇匀,在每个平板内分别加入此含菌培养基 5 ml,使其在底层上均匀分布,置水平位置凝固后,在每个双层平板中以等距离均匀放置牛津杯 6 个,用陶瓦圆盖覆盖备用。
6. 标准曲线的制备 取上述制备的扩散平板 18 个,在每个平板上的 6 个牛津杯间隔的 3 个中各加入 1 U/ml 的标准品溶液,将每 3 个平板组成一组,共分 6 组。 在第一组的每个平板的3个空牛津杯中均加入 0.4 U/ml 的标准液,如此依次将 6 种不同浓度的标准液分别加入 6 组平板中(如图 IX-6),每一稀释度应更换一只吸管,每只牛津杯中的加入置为 0.2 ml 或用带滴头的滴管加样品,加样量与杯口水平为准,全部盖上陶瓦盖后 37 ℃ 培养 16~18 h。 精确测量各抑菌圈的直径,分别求得每组 3 个平板中 1 U/ml 标准品抑菌圈直径与其他各浓度标准品抑菌圈直径的平均值,再求出 6 组中 10 U/ml 标准品抑菌圈直径的平均值,总平均值与每组 10 U/ml 标准品抑菌圈直径平均值的差,即为各组的校正值。 例如,如果 6 组 1 U/ml 标准品抑菌圈直径总平均值为 22.6 mm,而 0.4 U/ml 的一组中 9 个 1 U/ml 标准品抑菌圈直径平均为 22.4 mm,则其校正数应为 22.6-22.4=0.2,如果 9 个 0.4 U/ml 标准品抑菌圈直径平均为 18.6 mm 则校正后应为 18.6+0.2=18.8 mm。以浓度为纵坐标,以校正后的抑菌圈直径为横坐标,在双周半对数图纸上绘制标准曲线。
7.青霉素发酵液效价测定 取扩散平板 3 个,在每个平板上的 6 个牛津杯间隔的 3 个中各加入 1 U/ml 的标准品溶液,其他 3 杯中各加入适当稀释的样品发酵液,盖上陶瓦盖后培养 16~18 h。 精确测量每个抑菌圈的直径,分别求出标准品溶液和样品溶液所致的 9 个抑菌圈直径的平均值,按照上述标准曲线的制备方法求得校正数后,将样品溶液的抑菌圈直径的平均值校正,再从标准曲线中査出标准品溶液的效价,并换算成每毫升样品所含的单位数。
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