1. 编号: 取无菌平皿 9 套,分别用记号笔标明 10-4 、10-5 、10-6 各 3 套。另取 6 支盛有 4.5 ml 无菌水的试管,排列于试管架上,依次标明 10-1 、10-2 、10-3 、10-4 、10-5 、10-6 。
2. 稀释 用 1 ml 无菌吸管吸取 1 ml 已充分混匀的大肠杆菌菌悬液(待测样品),精确地放 0.5 ml 至 10-1 的试管中,此即为 10 倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。 将 10-1 试管置试管振荡器上振荡。使菌液充分混匀。 另取一支 1 ml 吸管插入 10-1 试管中来回吹吸菌悬液三次,进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快,吸时吸管伸入管底,吹时离开液面,以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。 用此吸管吸取 10-1 菌液 1 ml,精确地放 0.5 ml 至 10-2 试管中,此即为 100 倍稀释……其余依次类推,整个过程如图 Ⅷ-3 所示。
3. 取样 用 3 支 1 ml 无菌吸管分别精确地吸取 10-4 、10-5 、10-6 的稀释菌液各 1 ml,对号放入编好号的无菌培养皿中。
4. 倒平板 尽快将上述盛有不同稀释度菌液的平皿倒入溶化后冷却至 45℃ 左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基约 15 ml/平皿,置水平位置,迅速旋动混匀,使培养基与菌液混合均匀,而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。 待凝固后,倒置于 37℃ 温室中培养。
5. 计数
培养 48 小时后,取出培养皿,算出同一稀释度三个平皿上的菌落平均数,并按下列公式进行计算:
每毫升中菌落形成单位 = 同一稀释度三次重复的菌落平均数 × 稀释倍数 × 5
一般选择每个平板上长有 30~300 个菌落的稀释度计算每毫升的菌数最为合适。同一稀释度的三个重复的菌数不能相差很悬殊。由 10-4 、10-5 、10-6 三个稀释度计算出的每毫升菌液中总活菌数也不能相差悬殊,如相差较大,表示试验不精确。
平板菌落计数法的操作除上述倾倒平板的方式以外,还可用涂布平板的方法进行(见微生物的分离和纯化实验)。二者操作基本相同,所不同的是涂布平板法是先将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板,待凝固后编号,并于 37℃ 温室中烘烤 30 分钟左右,或在超静工作台上适当吹干,然后用无菌吸管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上,并尽快用无菌玻璃刮棒将菌液在平板上涂布均匀,平放于实验台上 20~30 分钟,使菌液渗透入培养基内,然后再倒置于 37℃ 的温室中培养 24~48 h。
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