标签: 精编分子生物学实验指南第五版第十六章
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1. 将含有冻存细胞的安瓿放入 37℃ 水浴中解冻。
2. 用 70% 乙醇对安瓿的顶端进行消毒,打开安瓿,用吸管将细胞转移到含有 5 ml 起始培养基的 25 cm2 组织培养瓶中,轻轻摇动培养瓶,使细胞均匀分布于培养瓶中,将其放入 5% CO2 加湿培养箱中 37℃ 培养过夜。
3. 吸出起始培养基,换成适当的维持培养基。将细胞放回 CO2 培养箱 37℃ 培养,每天检查细胞是否生长至汇片。
4. 如果细胞生长至汇片,吸出培养基。
5. 用 PBS 或胰酶/EDTA 清洗细胞,除去细胞上残留的血清,将洗液吸出。
6. 用 37℃ 、适当体积的胰酶/EDTA 刚好覆盖单层细胞(如对于 25 cm2 培养瓶需要 0.3 ml)。消化 30~40 s(细胞应该分开),晃动培养瓶使细胞完全分开。
7. 加入 1.4 ml 适当的维持培养基,用吸管来回吹打细胞悬液多次以打散细胞团(这些细胞用于传代)。
8. 吸出 0.5 mL 的细胞悬液,将其加入到新的含有 30 ml 维持培养基 150 cm2 的组织培养瓶中。轻轻摇动培养瓶,使细胞均匀分布于培养瓶中,将其放入 CO2 培养箱中 37℃ 培养直到细胞生长至汇片(大约 1 周)。大约间隔一周用维持培养基进行 1:20 稀释传代以维持细胞生长。
1. 将含有冻存 HeLa S3 细胞的安瓿放入 37℃ 水浴中解冻。
2. 用 70% 乙醇对安瓿的顶端进行消毒,打开安瓿,用吸管将细胞转移到含有 5 ml 完全 MEM-10 培养基的 25 cm2 组织培养瓶中,轻轻摇动培养瓶,使细胞均匀分布于培养瓶中,放入 5% CO2 加湿培养箱中 37℃ 培养过夜。
3. 将培养基吸出,用 0.5 ml 37℃ 的胰酶/EDTA 覆盖细胞,消化 30~40 s。
4. 加入 10 ml 旋转瓶完全培养基-5,并将细胞转移至 50 ml 的离心管中。室温 1800 g 离心 5 min,弃上清。
5. 将细胞沉淀悬浮在 5 ml 的旋转瓶完全培养基-5 中,上下吹打,将细胞团打散。
6. 在 100 ml 或 200 ml 通气旋转瓶中加入 50 ml 旋转瓶完全培养基-5,并将细胞悬液转移到瓶中。
7. 取出 1 ml 细胞悬液,用血细胞计数器(附录 3F) 进行细胞计数。加入适量的旋转瓶完全培养基-5,使细胞密度为(3~4)× 105 细胞/ml。将细胞放入无 CO2 培养箱,37℃ 旋转培养。
8. 随后的两天让细胞继续生长,并且每天对细胞进行计数,加入适量的旋转瓶完全培养基-5 以维持(3~4)×105 细胞/ml 的细胞密度。
9. 取 1 ml 的细胞悬液,用血细胞计数器对细胞进行监测。
10. 当细胞密度达到(4~5)×105 细胞/ml 时,隔天或每天用培养基将细胞稀释至 1.5×105 或 2.5×105 细胞/ml。
11. 分别将装有 50 ml 或 100 ml 细胞悬液的 100 ml 或 200 ml 通气旋转瓶放入 37℃ 无 CO2 培养箱旋转培养。每天或隔天传代。
A375培养问题
我在A375培养过程中,一次传代后出现悬浮颗粒物(还很多),然后我换了一次液。第二天仍然出现了这种状况。但是贴壁的细胞长多了的。请大神们指点指点。谢谢
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精编分子生物学实验指南 (第五版
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