(一)将TT12399的Mini-Tn10d-tet引入TT13976
1.挑取供体菌TT12399单菌落接种于5mlLB液的试管中,置37℃振荡培养过夜,取1ml过夜培养物加到5mlP22肉汤中,37℃振荡培养8~16h。经4000r/min离心10min,收集上清液即为TT12399的P22裂解液。
2.接种TT13976于LB培养液,37℃振荡培养过夜。
3.取0.1mlTT13976的过夜培养物和0.1ml适当稀释的P22裂解液进行混合,然后涂布在LB(Tet)平板上,置37℃培养过夜。
4.挑取在LB(Tet)平板上的单菌落进行分离纯化,选择不含噬菌体的菌株作为三点杂交的供体菌。
(二)三点杂交
1.按常规制备上述供体的P22裂解液。
2.接种受体菌TT10251于LB培养液中,30℃振荡培养过夜。
3.取0.1mlTT10251的过夜培养物和0.1ml适当稀释的供体菌株P22裂解液,混合后涂布在LB(Tet)平板上,置30℃培养过夜。
(三)转导子基因型的测定
1.在上述LB(Tet)平板上生长的菌落为四环素抗性转导子。用无菌牙签将这些菌落逐个挑取分别点种在LB平板上(挑200个菌落),置30℃培养过夜。
2.以上述平板菌落长出后作为母平板,将其分别影印在NCE(Man-Tet)和LB(Tet-Kan)平板上,置30℃培养24~48h。
3.对比观察NCE(Man-Tet)和LB(Tet-Kan)平板上菌落的生长情况。
4.记录四种表型组合KansMan-,KansMan+,KanrMan-和KanrMan+的转导子数,并计算各表型组合出现的百分比。
5.确定zxx1900::Tn10d-tet、add和pmi三个基因的排列顺序。
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