1. 噬菌体的分离
1.1 制备菌悬液 37℃ 培养 18 h 的大肠杆菌斜面一支,加 4 ml 无菌水洗下菌苔,制成菌悬液。
1.2 增殖培养 于 100 ml 三倍浓缩的肉膏蛋白胨液体培养基的三角烧瓶中,加入污水样品 200 ml 与大肠杆菌悬液 2 ml,37℃ 振荡培养 12~24 h。
1.3 制备裂解液 将以上混合培养液 2500 r/min 离心 15 min。 将无菌滤器用无菌操作安装于灭菌抽滤瓶上,常规操作连接真空抽滤装置。将离心上清液倒入滤器,开动真空泵,过滤除菌。所得滤液经 37℃ 培养过夜,以作无菌检査。
液体抽滤完毕,应打开安全痕的放气阈增压后再真空泵,否则将产生滤液回流,污染真空泵。
1.4 确证试验 经无菌检査没有细菌生长的滤液作进一步证实噬菌体的存在。
1.4.1 于肉膏蛋白胨琼脂平板上加一滴大肠杆菌悬液,再用灭菌玻璃涂榉将菌液涂布成均匀的一薄层。
1.4.2 待平板菌液干后,分散滴加数小滴滤液于平板菌层上面,置 37℃ 培养过夜。如果在滴加滤液处形成无菌生长的透明噬菌斑,便证明滤液中有大肠杆菌噬菌体。
2. 噬菌体的纯化
2.1 如已证明确有噬菌体存在,则用接种环取滤液一环接种于液体培养基内,再加入 0.1 ml 大肠杆菌悬液,使混和。
2.2 取上层琼脂培养基,溶化并冷却至 48℃(可预先溶化、冷却,放 48℃ 水浴箱内备用),加入以上噬菌体与细菌的混合液 0.2 ml,立即混匀。
2.3 并立即倒入底层琼脂平板上,铺匀,置 37℃ 培养 24 h。
2.4 此法分离的单个噬菌斑,其形态、大小常不一致,需要进一步纯化,噬菌体纯化的操作比较简单,通常采用接种针(或无菌牙签)在单个噬菌斑中刺一下,小心采取噬菌体,接入含有大肠杆菌的液体培养基内,37℃ 培养。
2.5 待管内菌液完全溶解后,过滤除菌,即得到纯化的噬菌体,
以上 2.1、2.2、2.3 三步骤,目的是在平板上得到单个噬菌斑,能否达到目的,决定于所分离得到的噬菌体滤液的浓度和所加滤液的量,最好在做无菌试验的同时,由教师先做预备试验,若平板上的噬菌斑连成一片,则需减少接种量(少于一环)或增加液体培养基的量;若噬菌斑太少,则增加接种量。
3. 高效价噬菌体的制备
刚分离纯化所得到的噬菌体往往效价不高,需要进行增殖。
将纯化了的噬菌体滤液与液体培养基按 1:10 的比例混合,再加入大肠杆菌悬液适量(可与噬菌体滤液等量或 1/2 的量),培养,使增殖,如此重复移种数次,最后过滤,可得到离效价的噬菌体制品。
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