1. 制备感受态细胞
1.1 将大肠杆菌 HB101 在 LB 琼脂平板上划线,37℃ 培养 16~20 h。
1.2 在划线平板上挑一个单菌落于盛有 20 ml LB 培养基的 250 ml 三角瓶中,37℃ 振荡培养到细胞的 OD600 值为 0.3~0.5 之间,使细胞处于对数生长期或对数生长前期。
1.3 将培养物于冰溶中放置 10 min,然后转移到 2 个 10 ml 预冷的无菌离心管中,4000 r/min,0℃~4℃ 亡离心 10 min。
1.4 弃上清,倒置离心管 1 min, 流尽剩余液体后,置冰溶 10 min。
1.5 分别向二管加入 5 ml 用冰预冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液悬浮细胞, 置冰浴中 20 min。 CaCl2 的纯度至关重要,不同厂家,甚至同一厂家不同批号的产品,均影响感受态的形成。
1.6 4000 r/min,0℃~4℃ 离心 10 min 回收菌体, 弃上清。分别向二管各加入 1 ml 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液,重新悬浮细胞,
1.7 按每份 200 ul 分装细胞于无菌小塑料离心管中,如果不马上用可加入终浓度为 10% 的无菌甘油,置 -20℃ 或 -70℃ 存备用。
制得的感受态细胞,如果在 4 ℃ 放置 12~24 h, 其转化率可增高 4~6 倍,但 24 h 后,转化率将下降。
以上均严格无菌操作。
2. 转化
2.1 加 10 ul 含约 0.5 ug 自制的 pUC18 质粒 DNA 到上述制备的 200 ul 感受态细胞中。 同时设三组对照:不加质粒;不加受体;加已知具有转化活性的质粒 DNA。具体操作参照下表进行。
2.2 将每组样品轻轻混匀后,冰浴 30~40 min, 然后置 42℃ 水浴热激 3 min, 迅速放回冰浴 1~2 min。
2.3 向每组样品中加入等体积的 2×LB 培养基,置 37℃ 保温 1~1.5 h, 让细菌中的质粒表达抗生素抗性蛋白。
2.4 每组各取 100 ul 混合物涂布于含氨苄青霉素(50 ug/ml)的选择平板上,室温下放置 20~30 min。
2.5 待菌液被琼脂吸收后,倒置平板于 37℃ 培养 12~16 h,观察结果。
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