1. P1 cml,clr 裂解液的制备
1.1 接种供体菌于 5 ml LB 培养液中,30℃ 振荡培养过夜。
1.2 将培养过夜的供体菌液按 1:5 稀释于 5 ml LB 液体中,振荡培养 2 h。
1.3 吸取 0.2 ml 菌液与 10-2 的 P1 cml, clr 噬菌体原液 0.1 ml 于上层 LB 半固体琼脂中,混匀后倒在底层 LB 固体培养基上,待凝固后置 37℃ 恒温箱培养过夜(共做四皿)。同时做一皿不加噬菌体的对照。
噬菌体原液的效价应每毫升 109 左右,细菌和噬菌体数的比大约是 20:1,以保证每个噬菌体都有机会感染一个细菌,半固体琼脂应先溶化,然后保温在 45℃ 左右,使之既不凝固,又不烫死细胞。
1.4 将噬菌体已增殖的上层半固体培养基琼脂刮到无菌三角瓶中,加入 5~10 ml LB 液体并加入几滴氯仿,剧烈振荡 20 s 后离心,上清液即为 P1 cml,clr 裂解液。将上淸液移到无菌试管中,加入几漓滴氯仿,再次剧烈振荡 20s 即可。
2. P1 cml,clr100 裂解液噬菌体效价的测定
在转导时要求噬菌体与细菌之比(即感染复数)要小于 1,因此,在进行转导实验之前需对噬菌体裂解液进行效价测定。
2.1 将 30℃ 中培养过夜的供体菌液按 1:5 加到 2 支盛有 5 ml LB 液体的试管中,30℃ 振荡培养 3 h 后, 混合 2 支试管中的菌液。
2.2 分别吸取 0.9 ml 菌液于 11 支无菌试管中,然后吸取如上制得的噬菌体裂解液 0.1 ml 于第一支菌液中,用 10 倍稀释法稀释成 10-1~10-10。在稀释的同时,取不同的稀释度的噬菌体细菌混合液 0.2 ml 加到 3 ml 的 LB 半固体中(融后保温在 45℃ 左右),摇匀后倒在 LB 固体培养基平板上。其中一支菌液不加噬体裂解液,倒一皿作为对照。平板冷凝后置 37℃ 恒温箱培养过夜。
噬菌体裂解液中加氯仿是为防止细胞污染,一般放冰箱 4℃ 保存。在吸取裂解液时,不要把吸头伸 a 到试管底部,以免吸进沉在底部的氯仿。
2.3 拿出平板进行噬菌斑计数,然后算出每毫升噬菌体原液中 P1 噬菌体的数目。
3. 转导
3.1 接种受体菌于 5 ml LB 液体中,30℃ 振荡培养过夜。
3.2 将上述过夜培养液按 1:5 稀释于 5 ml LB 液体中,30℃ 振荡培养 2~3 h 后,在培养液中加入 CaCl2, 使之终浓度为 5×10-3 mol/L(Ca2+有助于 P1 噬菌体对受体细胞的吸附)。
3.3 取如上制得的噬菌体裂解液(滴定度约为 1010 /ml 左右),用无菌生理盐水稀释到 10-3 取 10-1,10-2, 10-3 稀释裂解液 1.5 ml 分别加入无菌试管,对每支试管再加入 1.5 ml 含有 CaCl2 受体菌培养液。
3.4 37℃ 保温 20 min, 取出后离心(3500 r/min,15 min),弃去上淸液后加入 1 ml 无菌生理盐水重新悬浮。
3.5 分别取重新悬浮液 0.1 ml 涂布在二种选择性培养基上(乳糖色氨酸基本培养基各涂 2 皿,葡萄糖基本培养基各涂 1 皿),并取未经噬菌体处理的受体菌液在二种选择培养基上各涂一皿作为对照,置 37℃ 恒温箱培养 2 d。
3.6 同时将含有 CaCl2 的受体菌液用无菌生理盐水稀释到 10-6,取 10-5 和 10-6 稀释菌液涂布在葡萄糖色氨酸基本培养基上,每皿涂布 0.1 ml,每稀释度涂布 3 皿,置 37℃ 恒温箱培养 2 d。
3.7 取出平板,进行菌落计数,计算转导频率。
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