由于大肠杆菌染色体 DNA 比通常用作载体的质粒 DNA 分子大得多,因此在提取过程中,染色体 DNA 易断裂成线型 DNA 分子,而大多数质粒 DNA 则是共价闭环型,根据这一差异便可以设计出各种分离、提纯质粒 DNA 的方法。碱裂解法就是基于线型的大分子染色体 DNA 与小分子环型质粒 DNA 的变性复性之差异而达到分离目的。在 pH 12.0~12.6 的碱性环境中,线型染色体 DNA 和环型质粒 DNA 氢键均发生断裂,双链解开而变性,但质粒 DNA 由于其闭合环型结构,氢键只发生部分断裂,而且其二条互补链不会完全分离,当将 pH 调至中性并在高盐浓度存在的条件下,已分开的染色体 DNA 互补链不能复性而交联形成不溶性网状结构,通过离心大部分染色体 DNA、不稳定的大分子 RNA 和蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。而部分变性的闭合环型质粒 DNA 在中性条件下很快复性,恢复到原来的构型,呈可溶性状态保存在溶液中,离心后的上清中便含有所需要的质粒 DNA,再通过用酚、氯仿抽提,乙醇沉淀等步骤而获得纯的质粒 DNA。