标签: PK-120基因 PCR 筛选 蛋白质技术手册第十四章
部分分解多肽氨基酸序列20个左右残基长度,用编码多肽两端的PCR引物进行PCR反应,能够检测PCR产物的长度,用此法得到的cDNA只有几十个碱基对,但它将成为后续筛选基因的重要突破口。来源:《蛋白质技术手册》
0 收藏 0 阅读
实验所需「试剂」具体见「其他」
1. 引物设计
PK-120 部分分解多肽氨基酸序列中,最长序列 K-15,16 为引物设计的依据:
1.1 考虑全部编码的组合,
1.2 考虑人编码的使用频率,设计 PCR 引物,正义链及反义链如用这些引物获得的 PCR 产物当中,50 bp 的产物为目的 cDNA。
2. PCR 扩增
从肝脏来源的 poly(A)+ RNA 中,用 Gene Amp RNA PCR 试剂盒如以下所述,合成 cDNA 0.1ug 的 poly(A)+ RNA 中,加入 5 mmol/L MgCl2:
1×PCR 缓冲液Ⅱ,
2 mmol/L dNTPs,
1u 的 RNase inhibitor,
2.5 umol/L random hexamers
2.5 u 反转录酶,
混匀,总体积为 20 ul。
在 PCR 扩增仪上反应,PCR 参数为 :
25℃ 10 min,
42℃ 30 min,
99℃ 5 min,
25℃ 5 min ,
第 1 循环反应,合成 cDNA。
在反应液中再分别加终浓度为 2 mol/L MgCl2,1×PCR 缓冲液Ⅱ,加 1nmol 3' 引物 5' 引物。混合,总体积为 100 ul。
94℃ 3 min 1 循环。
94℃ 1 min,
37℃~42℃,2 min,
72℃, 2 min,
40 循环。
72℃, 7 min,1 循环。
3. 凝胶电泳及提取 DNA
纯化 PCR 产物后,在 0.25×TBE 溶液中,进行 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳,分子量标准使用限制性酶 Msp1 消化的质粒 pBR322。电泳结束后,凝胶经溴化乙锭染色,紫外照射,观察到 50 bp 的 PCR 产物。将这 50 bp 的条带切下,在抽提液中,室温放置过夜之后 1200 r/min 4℃ 离心 10 min,回收上清。反复操作两次,用乙醇沉淀 2 次,用 TE 液溶解,上样 Sephadex-50 柱,再用乙醇沉淀洗脱组分,沉淀悬浮于 TE 溶液中。
4. 测定碱基序列
抽取提出的 PCR 产物用 PCRⅡ载体亚克隆,测定碱基序列。其结果以肝脏 poly mRNA 为模板,据引物 S15-i 和 A15-i 扩增的 50 bp 的 PCR 产物序列,和从氨基酸序列预测的碱基序列完全一致。表明这是编码母的部分分解多肽的 cDNA。
试剂:
Sephadex-50
Gene Amp RNA PCR 试剂盒
合成寡聚核苷酸用 BIO-SYNTHESIS,INC 公司产品合成寡聚核苷酸
抽提液
750 mmol/L 醋酸铵-10 mmol/L 醋酸镁-0.1 mmol/L EDTA-0.1%SDS-1%TE 饱和酚
25ug/ml 酵母 tRNA
其他他试剂均为市售
更有优质直播、研选好物、福利活动等你来!
本网站所有注明“来源:丁香园”的文字、图片和音视频资料,版权均属于丁香园所有,非经授权,任何媒体、网站或个人不得转载,授权转载时须注明“来源:丁香园”。本网所有转载文章系出于传递更多信息之目的,且明确注明来源和作者,不希望被转载的媒体或个人可与我们联系,我们将立即进行删除处理。
我的询价
询价列表
暂时没有已询价产品
手机验证
科研好物关注研选号