标签: 病毒DNA提取 病毒学检验第一篇第九章
在用PCR技术检测病毒DNA和RNA过程中,病毒核酸的提取,也即DNA模板的制备,至关重要。来源:《病毒学检验》
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1. 在 750µl 全血中加入等量裂解缓冲液 A,混匀, 12000 r/min 离心 30 s, 弃上清液。
2. 用 1.5mL 裂解缓冲液 A 悬起沉淀,再重复离心 1次,弃上清液。
3. 用 117µL 裂解缓冲液 B 溶解沉淀, 70℃作用 5 min, 待冷却至 55℃时加入3µL 蛋白酶 K, 并保温1h 消化细胞, 95℃ 10 min 灭活蛋白酶 K 。
4. 加入 2 mol/L 的 KCL 溶液 30µL, 冰溶 5 min 。
5. 12000 r/min 离心 5 min, 弃上清液做 DNA 模板。即获得病毒DNA。
1. 裂解缓冲液 A 由 320 mmol/L蔗糖、 10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.6) 、 5mmol/L MgCl2和1% Triton-X-100 组成。
2. 裂解缓冲液 B由10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.6) 、 1% SDS 组成。
3. 蛋白酶 K(25 mg/ml) ,ddH2O配制,-20℃保存。
1. 贴壁培养细胞倾去培养液,加 PBS 洗 2次,加胰蛋白酶消化 (37℃, 5~10 min)后移入Ep管中,2000 r/min 离心 10 min, 弃上清液,用 PBS 悬浮细胞,离心洗涤 2~3次,用 PBS 重新悬浮细胞, 3500 r/min, 弃上清液。
2. 悬浮细胞的培养 移入 Ep 管中,以 2000 r/min 离心 10 min, 弃上清液,用 PBS 悬浮细胞,余下的操作同贴壁培养细胞。
3. 加人 1/2 体积 2M NaCl 和 1/2 体积 20% PEG 6000( 聚乙二醇 6000), 充分混匀溶解,置于 4℃ 8~12 h 或过夜, 3500 r/min 离心 20 min, 弃上清液。
4. 加 1/10 原培养液体积的裂解液,混匀, 37℃作用 2~3 h 。
5. 用等体积的平衡酚抽提 1次,再用氯仿/异戊醇 (24:1)抽提 3~4次。
6. 加入 1/10 体积 2.5mmol/L NaAc pH 和 2倍体积无水乙醇,置- 20℃过夜。 15000 r/min 离心 10 min, 弃上清液,用 70% 乙醇洗 1次,倒置离心管自然干燥或真空抽干。
7. 加适量 TE 缓冲液溶解沉淀,做 DNA 模板。获得病毒DNA。
1. 裂解液由 0.5%SDS 、10mmol/L Tris-HCl(pH 7.8)、5 mmol/L EDTA 、10 µg/ml RNase和 50µg/ml 蛋白酶 K 组成。
2. TE 缓冲液由 10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.8) 和 10 mmol/L EDTA 组成。
1. 取新鲜或刚解冻的组织去除血水和结缔组织,在冰浴上剪成小碎块。
2. 将组织碎块移入预冷的匀浆器中,按 10 ml/g 加入匀浆缓冲液,混匀,制成匀浆液。
3. 将匀浆液移人 Ep 管, 5000 r/min 离心10 min, 弃上清液。
4. 加 10 mmol/L PBS(pH 7.4)悬起沉淀,每0.1g 原始组织加1ml, 5000 r/min 离心 10 min,弃上清液。
5. 加裂解液悬起沉淀,每 0.1g原始组织加1ml, 55℃作用 30~60 min,然后于95℃, 10 min灭活蛋白酶 K 。
6. 1000 r/min 离心5 min, 取上清液做 DNA 模板, 4℃保存备用。
1. 匀浆缓冲液 由 0. 25 mmol/L 蔗糖、25mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、25mmol/L NaCl 和25mmol/L MgCl2 组成。
2. 裂解液由 50 mmol/L Tri s-HCl (pH 8.3) 、1 mmol/L EDTA 、0.5 % Tween-20 和200µg/ml 蛋白酶 K 组成。
预操作:将采有口腔、鼻腔或生殖道等处分泌物标本的棉签置于 2 ml 生理盐水中,洗下标本。若标本在 4 h 内处理,可置于室温保存,否则需 4℃保存。
1. 将生理盐水中的标本以 2 000 r/min 离心 5 min, 沉淀细胞。
2. 吸去上清液,若有血液残留,可1 ml TE 缓冲液悬浮细胞,移至Ep管中,重复离心1次。
3. 去上清液,如仍有血液残留,可重复第 2 步,直至沉淀物中无红细胞痕迹为止。
4. 用 50~300µ1 裂解液悬浮细胞,使细胞达到 10~1000 个/µl 。
5. 用 55℃,1 h 消化裂解细胞,释放 DNA, 然后 95℃ ,10 min 灭活蛋白酶 K 。
6. 10000 r/min 离心 5 min, 取上清液做 DNA 模板。
1. TE 缓冲液由 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0) 和 1 mmol/L EDTA 组成。
2. 裂解液由 50 mmol/L KCl、10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、2.5 mmol/L MgCl2、100 µg/ml 蛋白酶 K 、1% Laureth-12 和 0.5%Tween-20 组成。
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