标签: 核酸 亲和层析 蛋白质 蛋白质技术手册第十二章
核酸亲和柱的应用极大地促进了核酸结合调节蛋白特性的研究,这些蛋白质涉及基因表达、染色体修复和复制、基因重组等的调控。核酸结合蛋白可以结合单链DNA、双链DNA或RNA。DNA结合蛋白结合DNA可以是序列特异的,也可以是非特异的。此外,含有特异寡核苷酸的亲和树脂能用于某些酶的分离,这些酶利用结构非常相似的辅酶,如NAD和NADP。总之,核酸亲和柱在各种蛋白质的纯化和特性研究中是一个有用的工具。来源:《蛋白质技术手册》
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DNA 偶联至溴化氰活化的 Sepharcse 4B 是通过它们本身的碱基实现的。从理论上讲,该方法也许干扰最佳结合序列的接近路径,但是这样一个简单的方法一直被广泛地成功应用。偶联效率的定量检测可经 A260 值测定评估,或者更精确地从偶联介质上水解核酸和进行磷酸盐测定。
1. 混悬 1.5 g CNBr-Sepharose 4B 在水中,室温静置 30 min 约可获得 5 ml 溶胀的胶。经烧结玻璃漏斗过滤,当水分滤尽而溶胀的胶仍是潮湿的时候,立即停止抽滤;
2. 胶在漏斗内,依次用 4℃,200 ml mmol/L HCl、200 ml 水和 200 ml 10 mmol/L,pH 8.0 磷酸钾缓冲液清洗;
3. 将胶移入含 2 ml 10 mmol/L,pH 8.0 磷酸钾缓冲液的 15 ml 试管内;
4. 加 50 ul 寡核苷酸到试管,约每 ml 胶需用 2nmol 寡核苷酸。室温下振摇 16 h;
5. 再移入烧结玻璃漏斗,抽滤除去液体;
6. 先后用 200 ml 水和 100 ml 1 mol/L,pH 8.0 乙醇胺-盐酸清洗;
7. 将胶移入聚丙烯试管,在 7 ml 1 mol/L,pH 8.0 乙醇胺-盐酸中混悬。室温下摇 4~6 h。该步骤灭活未偶联的活化的胶;
8. 在烧结漏斗中,依次用下述溶液洗胶。100 ml 10 mol/L,pH 8.0 磷酸钾缓冲液;100 ml 1 mol/L,pH 8.0 磷酸钾缓冲液;100 ml 1 mol/L KCl;100 ml H2O;100 ml 储存缓冲液(10 mmol/L pH 7.6 Tris-HCl,0.3 mol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,0.02% NaN3;
9. 4℃可储存一年。
在上样品液到核酸亲和柱之前,建议首先采用其他的纯化方法,如硫酸铵沉淀、离子交换或凝胶过滤层析等富集目的蛋白。这样可以除去绝大多数的污染物,并减少非特异结合。亲和层析柱一般来讲是短而粗的,例如长宽比为 2:1。
1. 10 倍柱体积的平衡缓冲液(20 mmol/L,pH 8.0 Tris-HCl,0.15 mol/L KCl,1 mol/L EDTA)平衡柱;
2. 调整样品液到相似的离子浓度(即 0.15 mol/L KCl);
3. 加非特异 DNA 到样品液内,每 ug 纯蛋白质加 100 ng。混匀后在冰上孵育 10 min。非特异 DNA 长度通常是 1 kb 左右,可以是 poly(dI-dC)或 poly(dA-dT),也可以是超声破碎的大肠杆菌、牛胸腺或鲑鱼精 DNA。为了除去孵育后可能形成的复合物,需 10 000×g 离心 10 min 弃去沉淀;
4. 缓慢地将样品液上样到亲和柱,流速 15 ml/h;
5. 5 倍体积平衡缓冲液洗柱;
6. 分别用 1 倍体积各含 0.2、0.3、0.6 和 1.0 mol/L KCl 的平衡缓冲液洗脱目的蛋白;
7. 检测各收集组分的活性,并汇集有特异活性的组分。因为蛋白质浓度时常较低,故常加入非离子型去垢剂 Triton X-100(终浓度 0.05%)以减少容器壁对蛋白质的吸附。需要注意的是该去垢剂会干扰 A280 测定;
8. 在 -70℃ 储存活性目的蛋白组分;
9. 用 10 倍体积的含 2.5 mol/L NaCl 和 0.5 mol/L EDTA 的平衡缓冲液洗柱使亲和柱再生。然后用含 0.02% NaN3 的平衡缓冲液再平衡后将柱 4℃ 储存。
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