1. 制备细胞。
先制备好单层细胞培养物,在低倍显微镜下观察,挑选生长良好的细胞,按「传代细胞培养」法进行,将细胞单层洗涤、消化、计数。配制所需浓度的细胞悬液,细胞数目可因细胞种类而异,通常为 20 万 -30 万/ml。预先将微量细胞培养板设计好,标记;用微量加样器将细胞悬液加人微孔中,每孔 200µl。
2. 孵育细胞。
将装有细胞悬液的微孔板置于 5% CO2 培养箱中, 37℃培养直至细胞生长成良好的单层。
3. 接种病毒。
用含 2%小牛血清的 Eagle's 维持液作为稀释液,将待测病毒作连续 10 倍稀释,如 10-1 、 10-2 、 10-3 …… 10-10 等。将培养板中的培养液全部倾弃,用微量加样器把每个稀释度的病毒液依次、对号加入各个微孔,每孔 100µl, 每个稀释度加 4 孔,同时设细胞对照孔 4 孔,不加病毒,只加稀释液,置于 37℃ 5% CO2 培养箱中培养。
4.观察结果。
于培养后的不同时间,如 18 h 、 24 h 、 36 h 等,在倒置显微镜下观察细胞病变情况。表示细胞病变程度。 通观整个「单层区」,权衡总的情况,以下列符号表示其病变程度:
-:表示无细胞病变。
+:表示 1%——25% 的细胞有病变。
++: 表示 26%——50% 的细胞有病变。
+++:表示 51%——75% 的细胞有病变。
++++: 表示 76%——100% 的细胞有病变。
5.记录结果。
病毒引起细胞病变效应的滴度以半数细胞培养感染量 (50% cell culture infectious dose, CCID50)表示,即凡能使 50%(半数)细胞出现病变的最高病毒稀释度,即为 50%感染单位,简称 CCID50。有时也称其为半数组织培养感染量 (50 % tissue culture infectious dose, TCID50) 。细胞病变效应出现的时间,不同病毒不完全一样,以感染细胞的病变不再发展,而对照细胞仍完好为准。
6.计算。
(1)CCID50的计算
Reed-Muench 法计算CCID50(图片插入http://res.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2017/08/B15022615761176i7hmtaq3r.png)
Karber 法计算 CCID50
公式: lg CCID50< 或 LD50 、 ID50)=L+d(S- 0. 5)
L—病毒的最低稀释倍数的对数;
d—稀释系数,即组距;
s---细胞病变比值的和(不包括最低稀释度细胞病变的比值)。
图片插入:http://res.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2017/08/B15022616615769hmgu53nbg.png
(2)ID50 和 LD50的计算
ID50的计算与CCID50完全相同,但依接种动物或胚胎是否受感染而判定,感染与否的判定标准如家兔在接种猪瘟病毒之热反应,鸡胚胎接种新城疫病毒后血球凝集。
LD50计算方法与前两者完全相同,只是判定标准是以接种动物或胚胎是否死亡判定的。
(3)CCID50 与 PFUs 的换算
如果用同一细胞系做 CCID50试验和空斑形成单位 (PFUs) 试验, 1 ml 病毒液将会产生的PFUs 约相当于 CCID50 滴度的一半。此时的感染量为至少在单层细胞上出现 1个病毒空斑。而实际测量时,在单层细胞上可能出现 1个以上的病毒空斑,因此需要按实际测量的空斑数计算。若按数学公式推导,预期的 PFUs 将会超过 CCID50 滴度的一半。因为在 CCID50测量时,阴性代表在单层细胞上出现的空斑数为 0, 阳性代表在单层细胞上出现 1个或 1个以上的空斑。
按照泊松分布的公式 P(O) =e(-m),P(O) 代表阴性孔数的比例, m 代表 PFUs/ml, 因为任何CCID50的 P(O)=0.5,因此, e(-m) =0. 5,m= —ln 0. 5≈0. 7 。所以 0. 7 乘以CCID50的滴度即为预计的 PFUs 。
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