1. 储存液的配置
(1)2 M Tris-HCl(PH 8.8),100ml 称取 24.2g Tris 碱;加 50ml 蒸馏水; 缓慢的加浓盐酸至 pH 8.8(约加 4 ml);让溶液冷却至室温,pH 将会升高; 加蒸馏水至 100 ml。
(2)1 M Tris-HCl(PH 6.8),100ml 称取 12.1g Tris碱; 加 50ml 蒸馏水; 缓慢的加浓盐酸至 pH 6.8(约加 8 ml);让溶液冷却至室温,pH 将会升高; 加蒸馏水至 100 ml。
(3)10%(w/v)SDS,100 ml。室温保存 称取 10 g 的 SDS; 加蒸馏水至总量为 100 ml。
(4)50%(v/V)甘油,100ml 到取 50 ml 100% 的甘油; 加入 50 ml 蒸馏水。
(5)1%(w/v)溴酚蓝,10ml 称取 100 mg 溴酚蓝; 加蒸馏水至 10 ml,搅拌直到完全溶解; 过滤除去聚合的染料。
2. 工作液的配置
(1)A液:丙烯酰胺储存液,100 ml 30%(w/v)丙烯酰胺,0.8%(w/v)双丙烯酰胺, 29.2 g 丙烯酰胺 0.8 g 双丙烯酰胺
3. 灌制分离胶
(1)组装凝胶模具叫按照使用说明书,装配好灌胶用的模具。 对于 Bio-Rad 的微型凝胶电泳系统,在上紧螺丝之前,必须确保凝胶玻璃板和隔片的底部与一个平滑的表面紧密接触(见图 1),钉细微的不匹配就会导致凝胶的渗漏。 图 1 Bio-Rad 的 Mini-Protean 凝胶模具组装示意图
(2)将 A 液、B 液及蒸馏水在一个小烧瓶或试管中混合,丙烯酰胺(A 液中)是神经毒素,操作时必须戴手套。
(3)加入过硫酸铵和 TEMKD 后,轻轻搅拌使其混匀(过量气泡的产生会干扰聚合)。凝胶很快会聚合,操作要迅速。
(4)小心将凝胶溶液用吸管沿隔片缓慢加入模具内(见图 2),这样可以避免在凝胶内产生气泡。 图 2 用滴管将凝胶溶液加入凝胶模具
(5)当加入适量的分离胶溶液时(对于小凝胶,凝胶液加至约距的玻璃板顶端 1.5 cm 或距梳子齿约 0.5 cm,见图 3)。轻轻在分离胶溶液上覆盖一层 1~5 mm 的水层,这使凝胶表面变得平整。 图3 分离胶聚合之前
(6)等待 30~60 min,使凝胶聚合。当凝胶聚合后,在分离胶和水层之间将会出现一个清晰的界面,可以微微倾斜模具,检测凝胶是否聚合。另外的办法是将灌完分离胶后剩余的凝胶溶液置于一个小容器内,作为检测凝胶聚合的标志。如果凝胶渗漏,但还没有覆盖水层。可以回收分离胶溶液,重新装配玻璃板和隔片,在凝胶聚合之前重新灌胶。分离胶可在 4℃ 储存一周。
4. 灌制堆积胶
(1) 吸尽覆盖在分离胶上的水;
(2) 将 A 液、C 液和蒸馏水在三角烧瓶或小试管中混合;
(3) 加入过硫酸铵和 TEMED,并轻轻搅拌使其混勻;
(4) 将堆积胶溶液用吸管加至分离胶的上面,直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端(见图 4); 图 4 将堆积胶溶液用吸管加入凝胶模具
(5) 将梳子插入凝胶内,直至梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐(见图 5 和图 6)。必须确保梳子齿的末端没有气泡。将梳子稍微倾斜插入可以减少气泡的产生; 图5 将加样孔梳子插入堆积胶
图6 堆积胶聚合之前
(6) 约 30 min 凝胶聚合;
(7) 凝胶聚合后,小心拔出梳子,不要将加样孔撕裂;
(8) 将凝胶放入电泳槽内,如果使用 Bio-Rad 的微型凝胶系统,可预先接好电极;
(9) 将电泳缓冲液加入内外电泳槽中,使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中。
5. 制备样品和上样
(1)每孔的上样量(Bio-Rad 的微型凝胶系统)
(2) 将蛋白质样品与 5× 样品缓冲液(20 ul+5 ul) 在一个 Eppendorf 管中混合;
(3) 100 ℃ 加热 2~10 min;
(4) 离心 1 s,如果有大量蛋白质碎片则应延长离心时间;
(5) 用微量注射器将样品加入样品孔中。将蛋白质样品加至样品孔的底部。 并随着染料水平的升高而升高注射器针头。避免带入气泡,气泡易使样品混入到相邻的加样孔中。
6. 电泳
(1) 将电极插头与适当的电极相接。电流应流向阳极;
(2) 将电压调至 200 V(保持恒压;对于两块 0.75 mm 的胶来说,电流开始时为 100 mA, 在电泳结束时应为 60 mA; 对于两块 1.5 mm 的胶来说,开始时应为 110 mA, 结束时应为 80 mA。);
(3) 对于两块 0.75 mm 的凝胶,染料的前沿迁移至凝胶的底部约需 30~40 min(1.5 mm 的凝胶则需 40~50 min);
(4) 关闭电源;
(5) 从电极上拔掉电极插头;
(6) 从电泳槽中取出凝胶玻璃板;
(7) 小心移动两玻璃板之间的隔片,将其插入两块玻璃板的一角。轻轻撬开玻璃板,凝胶便会贴在其中的一块板上。
7. 考马斯亮蓝染色
(1)戴上手套避免将手指印留在电泳胶上,将胶移入一个小的盛有少量考考马斯亮蓝(20 ml 已经足够)的容器内(小心不要将胶撕破)、或将玻璃板连同凝胶浸在染料中轻轻振荡直至凝胶脱落;
(2)对于 0.75 mm 的凝胶,可在摇床上缓慢震荡 5~10 min,对于 1.5 mm 的凝胶,则需 10~20 min, 在染色和脱色过程中要用盖子或封口膜密闭容器口;
(3) 弃去染液,将凝胶在水中漂洗数次。戴手套以避免将双手染色;
(4) 加入考马斯亮蓝脱色液(约 50 ml),清晰的条带很快会显现出来,大部分凝胶脱色需要 1 h, 使用过的脱色液则可用水冲冼掉。为了脱色完全,需数次更换脱色液并震荡过夜。
8. 银染色
(1) 戴上手套,将凝胶移至一个盛有 50% 中醛和 10% 醋酸混合液的小容器内,至少浸泡换液 2~3 次;
(2) 用清水漂洗 30 min, 期间至少换水 3 次;
(3) 准备溶液 A,B、C;
(4) 将凝胶移入一个干净的容器内,在持续温和振摇下用 C 液染色 15 min;
(5) 用去离子水漂洗凝胶,在轻轻振摇下浸泡 2 min;
(6) 准备溶液 D;
(7) 将凝胶移至一个干净的容器内,用溶液 D 洗涤,显色。银染的电泳带一般在 10 min 内出现,则更换溶液 D。如果背景已开始变为淡黄色,则应该停止反成;
(8) 将凝胶浸入 1% 的醋酸终止反应;
(9) 在蒸馏水中漂洗凝胶至少 1 h, 换水三次;
(10) 如果蛋白质染色太深,则可用 Kodak Rapid Fix 或 Kodak Rapid Unfix 使电泳胶脱色再用 Kodak clearing agent(如 Orbit) 终止脱色,然后用 50 % 甲醉/10 % 的酷酸漂洗;
(11) 将凝胶保存于水中或进行干胶。
9. 干胶
(1) 将凝胶置于一个干净的表面上(玻璃板或洁净的操作台上);
(2) 用蒸馏水做润滑剂,调整加样孔间隔胶便其保持垂直;
(3) 用一张 10 cm×12 cm 的 Whatman 3 MM 滤纸覆盖凝胶,将滤纸连同凝胶从玻璃板或操作台上揭下来,凝胶会粘在滤纸上;
(4) 用一张玻璃纸或塑料保鲜膜覆盖在凝胶的表面,小心不要将气泡裹进去,这样会导致凝胶的破裂。可用一个试管作为卷轴拖运可以有效的除去气泡;
(5) 将 Whatman 滤纸与凝胶置于干胶器上,开启加热和抽真空开关,并盖上带有密封圈的盖子。
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