标签: FACS 人干细胞培养第十一章
来源:《人干细胞培养》
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(a)胰蛋白酶消化2〜4代的间质细胞。
(b)细胞计数,用DMEM/2FB将细胞稀释至1×106个细胞/ml。
(c)加入5μg/mL (Hoechst33342染料,37℃,90 min,每20 min搅动一次。
(d)对照组细胞在加人Hoechst33342染料前,先加入50μg /ml维拉帕米孵育20min。
(e)染色后,在4℃环境下用HBSS/2FB将细胞洗两遍并离心,之后在冰上用冷HBSS/2FB重悬细胞。
(f)于分选前加入2μg/ml PI以鉴别无活性的细胞。
(g)无菌条件下分选细胞,高速细胞分选仪,用350nm激发。收集蓝色(670 nm)和红色(450 nm)荧光均减弱的细胞。边群细胞通过上述步骤与死细胞和完全被染料标记的细胞分离开并被收集起来。对照组要确保用维拉帕米先行孵育后使边群细胞消失。
(a)胰蛋白酶消化2〜4代的细胞并计数。
(b)400g离心,10min。
(c)PBSA/BSA洗一遍。
(d)加入10μL抗体(MAB4155F、克隆5D3抗ABCG2-FITC或同型抗体-FITC),30 min,置于冰上。
(e)用PBSA/BSA洗一遍后离心。
(f)用高压高速的细胞分选仪进行流式细胞分选术。488nm的氩激光发生器用于激发荧光素异硫氰酸盐,525/20带通滤波器用于测量发射光。用侧向散射对前向散射的双参数图上的门来除外细胞碎片。收集至少100000个细胞用于分析。
(g)分选出的ABCG2阳性和阴性的细胞群可以用于检测它们的集落形成率,干细胞标志性基因的表达,以及继续传代用于更进一步的研究和体内移植等。
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