A.组织收集和细胞分离
(a)无菌条件下,用10号解剖刀片小心从软骨下骨下面解剖软骨(见本方案后的注解1)。将软骨薄片置于含PBSA的9cm Petri培养皿中。
(b)用镊子和刀片仔细将软骨切成1 mm3小块。
(C)将软骨小块转移至含18 mL链霉蛋白酶消化培养基的普通器皿或离心管中。
(d)置于滚转机37℃处理1 h。
(e)吸出消化液弃之。
(f)加人18 ml胶原酶消化培养基,再次置于滚转机37℃处理1 h。
(g)细胞滤网过滤,,
(h)用血细胞计数板进行细胞计数。
(i)加人黏附测定培养基,620g离心10 min进行洗涤,用黏附培养基以2000个细胞/ml密度重悬细胞(4000个细胞)。
B.差异黏附测定
(a)用10μg/ml纤连蛋白包被3.5cm Petri培养皿,4℃过夜。阴性对照使用10μg/ml BSA。
(b)吸出液体,用含1 mg/ml BSA的PBSC封闭培养皿30min。
(c)加人2 ml培养基重悬的细胞悬液静置20 min。
(d)吸出培养基和未贴壁细胞,置于第二个培养皿中20 min。
(e)向第一个培养皿中加人2 ml生长培养基后置于鮮箱。
(f)从第二个培养皿中吸出培养基和未贴壁细胞至第三个培养皿中。
(g)向第二个培养皿中加人2 ml生长培养基后置于孵箱。
(h)向最后一个培养皿中加人200μl FBS后置于孵箱。
(i)3 h后,用相差显微镜计数最初贴壁的细胞。
(j)培养细胞,至明显可见多于32个细胞的集落(见注解2),一般需10天。
(k)用以下公式计算集落形成率(GFE):
CFF=χ天的集落数/0天贴壁细胞的细胞数
集落扩增
(a)用相差显微镜鉴定多于32个细胞的细胞集落,在培养皿下用记号笔将其画圈标记(见注解4)
(b)计数和记录每个集落的细胞数
(C)从Petri培养皿中吸出培养基,用PBSA润洗。
(d)在克隆环上无菌涂抹凡士林,或者使用无菌镊子直接将其浸人凡士林
(e)将克隆环置于集落上(见注解5),向圈中加入胰蛋白酶/EDTA溶液5〜10 min—相差显微镜观察细胞已脱离。
(f)重悬细胞,置于Eppendorf管中,300g离心5min(见注解6)
(g)生长培养基洗涤,重复上述离心。
(h)生长培养基稀释,12孔板中每孔接种1个集落。
(i)细胞汇合时接种至3.5cm培养皿(或6孔板),然后再移至较大培养瓶25cm2,75cm2最后为175cm2。
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