标签: MSCs 人干细胞培养第九章
缩小细胞培养体积试验证明,MSCs最好培养于直径15cm的Nunclon或Corning板中,面积在140cm2和150cm2之间。细胞产率取决于培养皿的数量,一般使用此方法传代,每个培养皿中可收获5X105个细胞。来源:《人干细胞培养》
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(a)检査所得的MSCs。如果培养物中小的、贴壁、纺锤形的成纤维细胞样细胞汇合至60%时,对其进行处理。如果单层细胞稀疏,继续润洗和更换培养基。
(b)按如下步骤消化单层细胞:用20 mL预热的PBSA润洗单层细胞后,加人5mL胰蛋白酶/EDTA。将培养皿置于37℃ 2min,在1O×放大倍数视野下观察单层细胞。贴壁细胞应正从塑料培养瓶上脱落。将培养皿置于37℃ 2min,再次观察。重复观察直到90%的MSCs已从培养瓶中脱落下来。加人5mL CCM,将10mL悬液移至15 mL离心管中,500g离心10 min。离心完毕,弃去上清,每管用1〜2mL预热的PBSA重悬沉淀。如有必要,混合多管细胞悬液只进行一次细胞计数。
(C)取10μL细胞悬液加人到10μL台盼蓝中,用血细胞计数器进行计数。合适的细胞悬液浓度为(2〜5)×105个细胞/mL,存活率需高于80%。胰蛋白酶消化后用于传代的早期培养物悬液,亦可进行集落形成单位(CFU)测定、冻存或分化测定。
(d)将细胞以50〜100个细胞/cm的密度接种到培养皿中,保持低密度以保证快速的自我更新和多潜能特性。用预热CCM以7×103(最终密度为50个细胞/cm2)到1×104(最终密度为100个细胞/cm2)的密度重悬MSCs。
(e)预备适当数量的15 cm培养皿,加人25 mL预热的CCM。
(f)接种1 mL步骤(b)和(c)所得的细胞悬液。来回滑动平皿(勿打圈)使细胞分布均匀。培养皿置于培养箱中,标记为一代细胞。
(g)培养2〜3天后,观察并评价形态。MSCs应为小的、纺锤体形状,频繁折光的双联体。此为培养良好的MSCs。
(h)从培养皿中吸出培养基,用20 mL预热的PBSA润洗,加入25 mL预热的新鲜CCM。
(i)每次传代时所需的培养皿数量取决于可以接种的细胞数量。方案中的上述体积适用于MSCs接种至单个15 cm培养皿。如有需要可按此例扩大以接种多个培养皿。
(a)所得的MSC细胞悬液,500g离心10min。
(b)在冻存管上标记细胞来源、日期和细胞代数。
(c)用预热的冻存液以1X106个细胞/ml的密度重悬沉淀,每个冻存管中加入1ml,分装成若干管。在DMSO存在的情况下,勿使MSCs在室温放置20min以上。
(d)向Cryo-1℃冻存容器内装人异丙醇至刻度线,将冻存管置于容器内。
(e)将容器置于-80℃至少15h。
(f)将冻存管转移至液氮,至少可保存3年。
(a)准备2个15 cm培养皿,加人25 ml预热的CCM。
(b)从液氮罐中取出所需的冻存管。将冻存管放人37℃水浴箱中解冻。此步骤需小心操作,戴好面罩。因为储存时出现问题,解冻的冻存管可能爆裂。
(c)细胞悬液融化后,取450μL加人每个培养皿中,在37℃,5%C02培养箱中至少培养18 h。
(d)第二天,用30 ml预热的PBSA润洗细胞,然后加人30 ml预热的CCM。
(e)进行传代处理
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