实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」 1. 对每一组 ds cDNA (A 和 B)配制 2 个限制性内切核酸酶消化反应(AluI 和 AluI+Rsal): 30 ng ds cDNA 3 ul 10×AluI 缓冲液 10 U AluI 或 10 U AluI+10 U RsaI 加水到 30.0 ul。 37℃ 温育过夜,确保完全消化。 最好使用产生平端的酶。如果不是产生平端的酶,需要另外补平或削平。
2. 65℃温育超过10 min失活内切酶。
3. 激酶处理寡核苷酸 a1 和 b1, 使用如下反应体系(每个反应体系 25 ul): 18.0 ul H2O 2.5 ul 10 mmol/L ATP 2.5 ul 10×T4 多聚核苷酸激酶缓冲液 1.5 ul 3 ug/ul 的寡核苷酸 a1 或 b1 0.5 ul 10 U/ul T4多聚核苷酸激酶 37℃ 温育 60 min。
4. 65℃温育20 min失活激酶。
5. 加入 1.5 ul 的寡核苷酸 a2 或寡核苷酸 b2 形成 a1/a2 或 b1/b2 连接子。混匀,最高速离心。45℃ 温育 10 min。
6.在 0.5 ml 的 PCR 管里,用合适的连接子为每组 cDNA 配制连接反应(130 ul 每个反应): 63 ul H2O 13 ul 10× T4 DNA 连接酶缓冲液 30 ul 40% PEG 8000 1ul 15 mmol/L ATP 10 ul AluI 消化的 cDNA 10 ul AluI/RsaI 消化的 cDNA 2 ul a1/a2 或 b1/b2 连接子 1ul 10 U/ul T4 DNA 连接酶 混匀,16℃温育2 h。
7. 将反应管放于冰上超过10 min。
8. 根据厂家说明书准备 Sephacryl S-300 离心柱。
9. 每个连接反应中加入 1 ul 75 mmol/L 的 ATP 和 1 ul T4 多聚核苷酸激酶。37℃ 温育 30 min。
10. 用 1 倍体积的 25:24 的苯酚/氯仿和氯仿依次抽提连接反应。
11. 连接产物离心过 Sephacryl S-300离心柱 ,除去未连接的连接子,用 Beckman Accuspin FR 离心机的吊桶转子室温,400 g 离心 2 min。
12. 两组 cDNA , 各配制 50 ul PCR反应体系: 35 ul H2O 5 ul 10×Taq DNA 聚合酶缓冲液 3 ul 25 mmol/L MgCl2 1 ul 10 mmol/L 4dNTP 混合物 0.5 ul 2.5 ug/ul 寡核苷酸 a2 或寡核苷酸 b2 5 ul 0.2 ng/ul 连接好的 cDNA A 或 cDNA B 0.5 ul 5 U/ul Taq DNA 聚合酶 加入几滴无菌的 PCR 级的矿物油覆盖反应体系。
13. 用下面的 PCR 程序扩增 cDNA : 30 个循环: 1min 94℃ (变性) 1 min 50℃ (复性) 2 min 72℃ (延伸) 25 s 72℃ (自动延伸) 对于没有自动延伸的热循环仪,延长延伸时间为 2~4 min。
14. 用琼脂糖凝胶电泳分析 5~10 ul 扩增好的 cDNA, 确定扩增 cDNA 的大小范围 (150 bp~1. 5 kb, 大部分为 250 bp)
15. 对两组扩增好的 cDNA, 各配制以下由放射性标记的测试 cDNA 的 PCR 反应体系 (每个反应体系 100 ul): 77 ul H2O 10 ul 10×Taq DNA 聚合酶缓冲液 6 ul 25 mmol/L MgCl2 2 ul 10 mmol/L 4dNTP 混合物 1 ul 稀释的[32P] dCTP 1ul 2.5 ug/ul 寡核苷酸 a2 或寡核苷酸 b2 2 ul A0 或 B0 cDNA (约 0.4 ug) 1 ul 5 U /ul Taq DNA 聚合酶 加入几滴无菌的 PCR 级的矿物油覆盖反应体系。
16. 对两组扩增好的 cDNA, 各配制 3 或4 个由生物素标记的驱动 cDNA 的 PCR 反应体系(每个反应体系100 ul): 73.3 ul H2O 10 ul 10×Taq DNA 聚合酶缓冲液 6 ul 25 mmol/L MgCl2 6.7 ul 驱动 dNTP 1ul 2.5 ug/ul 寡核苷酸 a2 或寡核苷酸 b2 2 ul cDNA A0 或 cDNA B0 (1~5 ng) 1 ul 5 U/ul Taq DNA 聚合酶 加入几滴无菌的 PCR 级矿物油覆盖反应体系。
17. 用步骤 13 中的 PCR 扩增程序进行测试和驱动 cDNA 的合成。
18. 按厂家说明,用商业化的阴离子交换 PCR 离心柱(Qiagen)纯化扩增的 cDNA,去除未掺入的核苷酸、引物和盐。
19. 用分光光度计定量产物核酸。
20. 配制 2 个杂交反应([32P] An-Bio-Bn 和[32P] Bn-Bio-An)。在一个 1.5 ml 硅烷化的微量离心管里,用乙醇沉淀 1 ug 放射性标记的测试 DNA 和 20 ug 的生物素标记的驱动 DNA,不要冷冻。风干沉淀,当沉淀刚刚干时,用吸头轻轻吹吸,重新溶于 5 ul HEPES 缓冲液。用手提式盖格计数器检测重新溶解的核酸溶液。
21. 转移重新溶解的 DNA 到一个 0.5 ml 的PCR管里。加入 5 ul 68℃ 的 2× 杂交缓冲液进行差减杂交。轻轻吹吸混匀,加入数滴无菌的 PCR 级的矿物油覆盖 DNA 溶液。最高速离心几秒。
22. 把两个管子在 95℃加热 10 min, 然后在 1 h 内慢慢冷却到 68℃,并继续在 68℃温育 2 h (快速杂交)。
23. 混合 7 ul 1 mol/L的 NaCl 和 140 ul HEPES 缓冲液,加热到 68℃。加入到杂交反应中稀释反应。混匀,最高速简单离心。冷却到室温。
24. 每管中取出 5 ul,保存(用作酚抽提前的总量计算)。
25. 每管中加入15 ul 链霉亲和素,涡旋混匀,室温温育 5 min。
26. 每管用等体积的 25:24 的苯酚/氯仿抽提。保留水相转移到新的管里。
27. 每管的水相中加入 10 ul 链霉亲和素。混匀,室温温育 5 min。
28. 用苯酚/氯仿和氯仿各抽提两次。测量每管的水相体积。
29. 每管中取出 5 ul,保存(用作酚抽提后的总量计算)。 被去除掉的测试cDNA的百分比用以下等式估算: % 去除的测试CDNA=100 一(酚抽提后总量 ×100/酿抽提前总量)
30. 用 An 或 Bn 测试 cDNA 和合适的驱动 cDNA 重复差减的过程(步骤 15~29)。驱动 cDNA 的选择由差减的策略决定。用 An 或 Bn 驱动 cDNA 进行快速杂交(2 h),用 A0 或 B0 驱动 cDNA 进行长时间杂交(30~40 h)。差减的进程用隙缝斑点杂交检测。
31. 用步骤 13 的程序扩增 5 ul 差减 cDNA (An 和 Bn)。用一个商业化的阴离子交换 PCR 离心柱纯化 PCR产物(如Qiagen)。
32. 用在连接子上有剪切位点的合适限制酶(针对于这里所用的连接子,如 Ec0RI 和 EcoRV)消化 cDNA。
33. 苯酚/氯仿抽提,乙醇沉淀纯化消化的 cDNA。
34. 把 DNA 连接到合适的载体中(如 EcoRI 或 EcoRV 切开的 pBluescript)。
35. 转化载体到感受态细菌里。
36. 铺板培养差减文库。 值得先通过滴定文库以获得单克隆。确定含插入片段克隆的百分比和插入片段的大小也很重要。 插入片段应当是 250 bp 左右。如果插入的片段 >500 bp, 则可以认为是插入了两个片段。
37. 从每个起始滤膜制备 4 个重复的印迹。
38. 按照厂家说明,变性、中和和交联印迹。
39. 用差减探针杂交这些重复的滤膜。
40. 从库里随机(如果估计库里绝大多数是差异表达的基因)或按照探针的杂交结果挑取 50~100 个差异表达的克隆。准备小量的质粒 DNA。
41. 对每个质粒里的插入片段进行测序,把含有相同序列的克隆归在一起。
42. 用起始组织的 RNA 分 析 [如 Northern 印迹、 RNase 保护分析、定量 RT-PCR 或者原位杂交确定这些克隆是否确实是差异表达的。 |