标签: 牙髓干细胞 人干细胞培养第八章
来源:《人干细胞培养》
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(a)用PBSA洗三遍,充分清洁牙齿表面。
(b)用消毒液消毒,然后再用PBSA充分清洗。
(c〕用连接牙科钻的牙科碳化转头,沿骨质和釉质的结合处切开牙齿,然后暴露髓腔。间歇地将牙齿在用冰预冷的PBSA.中浸泡避免切割过程中过热。在SHED分离时,有时由于牙根吸收牙髓已经暴露了,就不需要进杆这个步骤。
(d)用小号精细镊或牙挖器,轻轻从牙髓腔中分离牙髓组织。
(e)将牙髓组织放人培养皿中的少量MSC培养液中。.注意不要使组织变干。
(a)用手术刀片将牙髓组织切成小碎片。
(b)将剪碎的组织放入胶原酶/中性蛋白酶混合溶液中(1:1)。
(c)37℃孵育30〜60min,间歇地摇匀组织/消化酶混合物。
(d)消化后,加人足够的MSC培养基,终止酶的活性。
(e)将悬液经70μm细胞滤膜过滤,去除细胞碎片,得到单细胞悬液。
(f)500g离心6min。
(g)倒掉上清液,用MSC培养基重悬细胞。然后进行免疫磁珠分选:和能与DPSC细胞反应的一抗孵育,包括STRO-I(小鼠抗人MSC;IgM),CC9(小鼠抗人CD146/MUC-18;IgG2a),或3G5(小鼠抗人外膜细胞;IgM),20Mg/mL,冰上孵育lh。用含1%BSA的PBSA洗两遍,600g离心6min。羊抗小鼠IgG或大鼠抗小鼠IgM结合磁珠的任意一个二抗孵育,4℃回转式混合仪40min。根据产品说明书推荐的方案,通过DyndMPC®-1磁分离器分离结合磁珠的细胞。
(h)细胞计数,按(1〜10)×103个细胞/cm2密度接种到培养瓶或皿上。
(i)在MSC培养基、37℃和5%CO2的培养箱中培养。
(j)细胞分离后7天,用PBSA洗培养瓶,更换培养基。之后可以一周两次更换培养基,直至细胞达到汇合。
(a)用PBSA洗培养瓶/皿三次。
(b)加足够的胰蛋白酶-EDTA溶液,37℃孵育。
(c)在80%的贴壁细胞从培养表面脱离时,加入MSC培养基。
(d)500g离心6min。
(e)倒掉上清,用MSC培养基重悬细胞。
(f)细胞计数,按需要的细胞密度接种。
(g)在MSC培养基,37℃和5%CO2的培养箱中培养。
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