标签: CB-MNCs 人干细胞培养第七章
来源:《人干细胞培养》
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(a)准备过柱缓冲液,用抽真空装置去除气体。
(b)每108个CB-MNCs用终体积300μL缓冲液重悬。
(c)每108个CB-MNCs悬液加100μL FcR阻断剂,抑制CD34微珠非特异性结合或通过Fc受体介导与非靶细胞的结合。
(d)每108个CB-MNCs悬液加100μL CD34微球进行细胞标记,充分混匀后在6〜12℃冰箱放置30min。
(e)加PBSA洗,室温200g离心10min;加适量的缓冲液重选细胞。
(f)根据CB-MNCs的细胞总数选择合适的柱子类型(MS+/RS+或LS+/VS+),将柱子放人MACs分离仪的磁场中。加人缓冲液润洗柱子(MS+/RS+:50μL;LS+/VS:3mL)。
(g)用30μm的尼龙过滤网过滤细胞,去除细胞团。使用前,用缓冲液湿润柱子。
(h)将细胞悬液加人柱子,使未结合的细胞通过柱子。
(i)用缓冲液将未结合的细胞洗去(MS+/RS+:3×500μL;LS+/VS:3×3mL)。
(j)洗脱结合的细胞。将柱子从分离仪中移出。置于合适的管中。将柱子加满缓冲液(MS+/RS+:1mL;LS+/VS: 5mL)。用柱子随带的内塞,加压将结合的细胞冲洗出来。
(k)加PBSA将CD34+细胞洗一遍,室温200g离心l0min。用适当的培养基重悬细胞。
(a)用添加细胞因子的培养基重悬细胞(50 ng/mL Flt-3配体,50 ng/mL干细胞因子,20 ng/mL促血小板生成素和10 ng/mL IL-6)。
(b)按2×104个细胞/mL的细胞浓度将CD34+细胞接种到T25培养瓶中。
(C)每周两次半量换液,补充细胞因子。
(a)将脐带血来源的间充质干细胞(blood-derived mesenchymal stem cells, CB-MSCs)作为饲养层细胞,用MSCs培养基重悬CB-MSCs,细胞浓度为5×104个细胞/mL。
(b)将CB-MSCs接种到6孔板
(C)每周两次半量更换新鲜培养基。
(d)当CB-MSCs达到以上汇合时,用10μg/mL丝裂霉素c处理,37℃ 2.5 h„
(e)用无血清IMDM将CB-MSCs洗两遍。
(f)按1×104个/mL CD34+细胞重悬于含细胞因子的共同培养基(100 ng/mL干细胞因子,100ng/mL IL-6,50 ng/mLFlt-3配体,10 ng/mL促血小板生成素)。
(g)将CD34+细胞接种到CB-MSCs饲养层细胞上。
(h)每周两次更换1/4培养基。
(i)2周后,收集未贴壁细胞。
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