6. 往 1.5 ml 洗脱下的 mRNA 显示蛋白中加入 200 ul 100 mmol/L EDTA 和 200 ul 1 mol/L NaOH,于 90°C 加热 10 min, 冰上冷却,然后加入 200 ul 1 mol/L HCl。
7. 参照厂家的说明用 NAP-25 凝胶过滤将缓冲液置换为去离子水。
8. 使 25 ml 去离子水流过柱子。
9. 将 200 ul 10 mg/ml 鲑精 DNA 与 20 ul 1 mg/ml BSA 加入 1780 ul去离子水中,涡旋振荡,然后使此溶液流过凝胶过滤柱。
10. 使 25 ml 去离子水流过柱子进行洗涤。
11. 测量样品体积并流过柱子,然后往柱中加入一定体积的去离子水,使得上柱总体积为 2.5 ml。
12. 加入 3.5 ml 去离子水到凝胶过滤柱的顶端,然后从柱底收集 3.5 ml 流出的洗脱液。
13. 用 PCR 扩增筛选的序列。在冰上配制下列 PCR 反应混合物:
3500 ul 筛选的 cDNA 库(来自步骤 12)
100 ul 100 umol/L 3' 引物(最终为 2 umol/L)
100 ul 100 umol/L 5' 引物(最终为 2 mmol/L)
40 ul 25 mmol/L (每个)脱氧核苷三磷酸(最终为 0.2 mmol/L)
500 ul 10×PCR 缓冲液,含 15 mmol/L MgCl2 (最终为 1×)
735 ul 水
25 ul 5 U/ul Taq DNA 聚合酶
总体积 5000 ul
循环数、温度和每一循环所需时间需要视所用的特定的库而定。应当对 DNA 库的 PCR 扩增监控,避免 DNA 库的过度扩增,因为(过度的扩增使得 DNA 库)一旦变性后不会再复性。如果对一个变性的 DNA 库继续进行 PCR 扩增,极少的序列能达到普通序列的扩增程度,这会降低所筛选的功能序列的富集因子。