1) 准备5〜8μm的冰冻切片,室温过夜晾干载玻片。石蜡切片也可以用;切片应该事先制备,水化,然后真空干燥。
2) 用PAP笔在每个切片周围的玻璃上划一条疏水界线。
3) 用1%多聚甲醛完全覆盖整个切片,在一个密闭的箱内室温孵育30 min。
4) 倒掉多聚甲醛,洗涤载玻片在含TBS的广口瓶或含染色托盘内室温孵育5 min,在孵育过程中,载玻片从该溶液浸入、取出3〜4次。
5) 用含0.1%(V/V) H2O2的TBS覆盖切片。置一个密闭箱室温孵育30 min,以猝灭内源的过氧化物酶活性。
6) 按照步骤4用TBS洗涤,用TdT反应液覆盖切片,以冲洗掉TBS。
7) 尽可能地去除反应液,加入25μL的TdT/地高辛-dUTP混合液。在加湿箱内37℃ 解育45〜60 min。
8) 用TBS洗涤载玻片一次,然后用2%马血清或含FBS的TBS洗一次,洗涤过程参照步骤4。
9) 用羊抗地高辛初级抗体溶液覆盖切面,在一个密闭箱内室温孵育1 h。
10) 按步骤8洗涤载玻片,然后用HRP共扼的抗羊二级抗体溶液覆盖切片,密闭箱内室温孵育1 h。
11) 按步骤8洗涤载玻片,然后用AEC底物工作液覆盖切片,室温孵育10〜20 min。
12) 按步骤8洗涤载玻片,在Mayer苏木精里孵育0.5〜1 min复染。然后用自来水在 Coplin广口瓶内洗漆5 min。
13) 擦去切片周围多余的水,用Crystal Mount封固盖玻片。
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