1a)石蜡切片或细胞的杂交,对载玻片进行脱蜡、水化、 封闭和脱水处理。将标本晾干(或在干燥器中干燥),随后储于加有干燥剂的载玻片盒中,置-70℃过夜。至关重要的是标本在储放前应绝对干燥。
1b)冰冻切片的杂交:进行切片的预处理和乙酰化处 理,随后进行切片的脱水。标本绝对干燥至关重要,此时切片即可用于杂交(步骤3)。杂交应马上进行。
2) 对每一杂交实验,可用乙醇沉淀10〜15 ng探针,重溶于10μL去离子的甲酰胺中, 加5μg (0. 5μL)超声处理的鲑精DNA,在70°C〜80°C温度下热变性探针10 min。
3) 加10μL主杂交混合液于变性探针中(探针终浓度为0.1〜0.5μg/mL)。混匀,微量 离心机以高速稍加离心,然后加于载玻片上。覆加22 mm2盖玻片,轻压以赶去大的气泡。放入加湿盒中,在37℃温育2〜4h。
杂交也可过夜,若杂交过夜,则用橡皮泥封住盖玻片。
4) 杂交最后30 min期间,以37℃水浴,在Coplin广口瓶中,预热50 mL 50%甲酰胺/ 2×SSC 洗液和 50 mL 2×SSC。
5) 从加湿盒中取出载玻片,剥去橡皮泥(如有使用的话)并小心移去盖玻片。在37℃ 50%甲酰胺/2 × SSC中,清洗杂交过的玻片15 min;接着以37℃ 2 × SSC洗15 min;再于室温以1×SSC洗15 min。
6) 玻片在室温下,以4×SSC平衡5 min。取出载玻片吸去残余缓冲液,在此过程中任何时候都不要使玻片干涸。
7) 加50μL生物素检测液、地高辛检测液或生物素/地高辛检测液于杂交过的载玻片上。用22 mm2大小的Parafilm覆盖,放在一用铝箔包裹的加湿盒中,于37℃温育 45 min。
8) 室温下,按顺序在裹以铝箔的Coplin广口瓶中,分别用4×SSC、0.1% Triton ×- 100/4×SSC和4×SSC浸洗切片。每种溶液中浸洗10 min。
9) 加50μLDAPI或碘化丙锭染色液于切片上,以一块22 mm2的Parafilm膜覆盖。室温下染色5 min。在盛有1×SSC的Coplin广口瓶中短暂浸洗,以除去多余染液。吸去残液但不要使切片干涸。
10) 加7μL适当的防褪色固片介质于已染色的切片上,覆以盖玻片。轻轻挤压除去多余的防褪色固片介质,注意勿损伤组织切片。以指甲油密封盖玻片,放在有干燥剂的玻片盒中,储于-20℃。
11) 用具落射光源以及有适合实验中所用荧光染料滤光片的荧光显微镜,观察实验结果。
12) 用Ektar-1000(用于打印)或EktachronnHtOO (用于载玻片)彩色感光片照相。 曝光时间依杂交信号亮度而定,但对DAPI的曝光时间为2 s,经双光区或三光区滤光片设施的 曝光时间分别为30〜90 s和3〜8 S。对亮的杂交信号可用黑白感光片,如用Kodak Technical Pan 2415 ASA 200感光片进行曝光。
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