标签: 免疫组织化学 精编分子生物学实验指南第五版第十四章
进行蛋白质定位的免疫组织化学技术。来源:《精编分子生物学实验指南》第五版
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1) 细胞置于冰上冷却,吸去培养液并以4℃的PBS洗涤,吸去PBS。
2) 如欲研究细胞表面抗原,则以2% PFA于冰上固定30 min。如研究细胞质抗原,则 可用含0.1% Triton×-100的2% PFA于冰上固定30 min,或以100%甲醇在普通冰箱的结冻室(-10〜-20℃)固定15 min。
两种固定细胞质抗原的方法均可获满意结果。然而,用高聚甲醛/Triton×-100固定通常可获更佳 的形态学观察结果,如采用甲醇固定法,应确保细胞在放入冰箱以前,先用甲醇充分予以洗涤,否则细胞会冻结。使用与泵连接的巴斯德吸管抽吸液体。
3) 吸去固定液,用4℃的PBS洗2次(5 min/次)。稀释的第一抗体于4℃用微量离心机以13 500 g离心2 min。
4) 加第一抗体于培养皿中,使其恰好覆盖细胞,4℃温育1 h。然后用4℃的PBS洗4次 (5 min/次)。
5) 稀释的第二抗体在4℃用微量离心机以13500 g离心2 min。
6) 加入第二抗体,4℃温育1 h。然后用4℃的PBS洗4次。
7) 若不想立即观察细胞,则将细胞于PBS中存放。盖好培养皿,以铝箔包裹,冷藏。 在24 h内观察此实验结果是很重要的,因荧光会迅速减弱或与细胞解离。
如用LabTek细胞培养玻片,可取玻片以Gelvatol进行封片处理。
1) 细胞在冰浴中冷却,然后用台式离心机在4℃以800 g离心5 min (用于淋巴细胞)。吸去培养液并以4℃的PBS重悬细胞。
离心机转速依细胞类型进行调整,但必须低转速离心,以防止损伤细胞。除非特别说明,否则所有离心步骤均在此条件下进行。
2) 离心,吸去PBS,以1〜2 mL 2% PFA固定液,或2% PFA固定液/0. 1% Triton ×- 100重悬细胞,置冰上固定30 min。
3) 离心、吸去固定液,用15 mL 4℃的PBS重悬细胞,放置5 min,再用PBS进行第二次洗涤。使用大体积缓冲液可以减少洗涤次数。
4) 第一抗体在4℃用微量离心机以13500 g离心2 min。250μL抗体足够用于5×106 细胞。
5) 离心细胞,吸去PBS,重悬细胞于第一抗体中,置4℃温育1 h。
6) 用4℃的PBS稀释细胞和抗体至15 mL。
7) 离心,吸去PBS,以4℃的PBS重悬细胞,重复1次。
8) 第二抗体4℃用微量离心机以13500 g离心2 min。5×106细胞用250μL抗体就 足够。
9) 吸去PBS,以第二抗体重悬细胞,4℃温育lh。重复步骤6及步骤7。
10) 除非立即观察细胞,否则在进行细胞最后浓缩的下一步操作之前应以铝箔包裹离心 管并冷藏。
11) 离心细胞并以少量PBS重悬(勿用水),将细胞悬液滴于多聚L-赖氨酸覆层的载玻片上,加上盖玻片,尽可能马上观察结果。
1) 将湿纸巾铺于载玻片盒底部做成加湿盒。从冰冻切片机或冰箱取出载有切片的载玻片,交叉放入玻片盒(每边约6片)或加湿盒中。勿使载玻片相互接触。
2) 待载玻片达到室温且未干时,于切片上铺加PBS,勿使溢出玻片。
3) 稀释的第一抗体于4℃用微量离心机以13500 g离心2 min (每一载玻片上加40〜 50μL抗体,应能盖住切片)。
4) 用与泵相连的巴斯德吸管,在切片的一端吸去玻片上的PBS,并从另一端加上抗体,盖上加湿盒,室温温育1 h。
5) 以PBS洗玻片3次(5 min/次)。
从切片一端加入新的PBS缓冲液,由另一端吸去旧的缓冲液。
6) 稀释的第二抗体于4℃用微量离心机以13500 g离心2 min。以每载玻片40〜50μL抗体计。
7) 将第二抗体加于切片上,置加湿盒中室温温育1 h。以PBS洗玻片3次(5 min/次)。
8) 将盖玻片放于纸巾上,滴加1滴Gelvatol于盖玻片中央。翻转载玻片放于盖玻片上,勿施压。将玻片置工作台上,用铝箔覆盖避光放置30 min,使Gelvatol凝结。
9) 显微镜下观察结果,或置玻片盒中储于4℃。
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