实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」
1. 制备 PCR 预混合物(共 3.775 ml): 500 ul 10×Taq 聚合酶缓冲液 5 ul 1 mol/L MgCl2 10 ul 100 mmol/L dATP 10 ul 100 mmol/L dGTP 50 ul 100 mmol/L dCTP 50 ul 100 mmol/L dTTP 125 ul 20 umol/L 引物 1 125 ul 20 umol/L 引物 2 2.9 ml 水
2. 对每一个样品,加入下列试剂到 PCR 管中: 12 ul 水 1 ul 肽适配体表达载体 10 ul Mg2+/Mn2+ 溶液 76 ul PCR 预混合物 1 ul Taq 聚合酶(5 U)
3. 用下列 PCR 反应程序进行扩增反应: 4 个循环: 30 s 95℃ (变性) 1 min 55℃ (复性) 1 min 72℃ (延伸)
4. 移出 13 ul 反应混合液到一新的 PCR 管中,新管中预先吸入: 10 ul Mg2+/Mn2+溶液 76 ul PCR 预混合物 1 ul Taq 聚合酶 用同样的 PCR 程序扩增。
5. 重复总共 10 轮的扩增。
6. 用 PCR 纯化柱或琼脂糖凝胶电泳纯化 PCR 产物。
7. 用 Ava II 消化纯化的 PCR 产物,然后按照标准的亚克隆技术将其亚克隆到经 II 酶切过的 PJM-I1中。
8. 用乙酸锂酵母转化法将 pBait 和 pBR1840 转入 EGY48 中。在 10 cm Glu/CM-His、-Ura 平板上筛选转化株。
9. 用高效乙酸锂方法将 10~50 ug 突变的肽适配体库转化含 pBait 和 pBR1840 的 EGY48。在 10 cm Glu/CM-His、-Ura、-Trp 平板上筛选转化株。
10. 收集转化株,测定平板效率。
11. 接种约 5 个库等价物到 1 ml Gal/Raf/CM-His、 -Ura、-Trp 液体培养基中。于 30℃ 振荡培养 4 h。
12. 室温下,于 3000 g 离心 4 min。弃上清,将酵母沉淀重悬于 1 ml 无菌水中。
13. 将酵母涂布到 15 cm Gal/Raf/CM-His、-Ura、-Trp, X-gal 平板上,于 30℃ 培养至克隆出现(约 2 天)。
14. 将蓝色克隆划线接种到一 10 cm Glu/CM-His、-Ura、-Trp 主平板上并于 30℃ 培养 1 天。
15. 将主平板复印到 10 cm Gal/Raf/CM-His、-Ura、-Trp、X-gal 平板和 Glu/ CM-His、 -Ura、-Trp、X-gal 平板上。
16. 从依赖半乳糖的蓝色克隆中回收质粒并重新导入,含有 pBait 和 pBR1840 的酵母株 EGY48 中以再次验证表型。
17. 从依赖半乳糖的蓝色克隆中回收质粒并对可变区进行测序。
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