标签: 抗体纯化 精编分子生物学实验指南第五版第十一章
单克隆抗体的纯化可用于:(1)制备体外诊断试剂;(2)制备治疗用药。
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目前常用的纯化方法有:盐析、凝胶过滤、离子交换层析和辛酸提取等方法达到纯化目的,也有采用较简便的酸沉淀法。最有效的纯化法为亲合纯化法,常用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠免疫球蛋白抗体与载体交联,制备亲合层析柱将抗体结合后洗脱,回收率可超过90%。
1)将蛋白 A-琼脂糖置于 50 倍体积的 Tris 缓冲液中充分溶胀。在室温下将其灌入直径为 2.5 cm 玻璃层析柱中,用 Tris 缓冲液平衡。
10-20 mL 腹水中的抗体,可用干重大约为 3 g 的蛋白 A-琼脂糖纯化。
2)腹水液稀释于 3 倍体积的 Tris 缓冲液,以 1-5 mL/min 的速度上样于蛋白 A-琼脂糖柱,用 Tris 缓冲液洗柱子直至所有的未结合的蛋白质都被洗脱,采用 A280 监测流出液。
3)依次用 2-3 倍柱床体积的柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液以及甘氨酸•Cl 缓冲液连续洗脱结合蛋白质,洗脱液直接接入装有中和缓冲液的管中。中和缓冲液的体积应为所收集液体积的 1/4。
4)采用 ELISA 法检测洗脱液的抗原特异性 MAb。
5)在超滤器中浓缩所分离的单克隆抗体到 1-5 mg/mL,所用超滤膜为 ×M50。将单克 隆抗体储存于-20℃。测定 A280。以计算抗体浓度,鼠的 IgG 溶液 1 mg/mL=1. 44 吸光度单位。
另一种缓冲液系统(由 Amersham Pharmac1a B1otech 建议的)对于某些单克隆抗体具有更高的结合能力。这些备择的缓冲液如下所示:
甘氨酸-OH 缓冲液(替换 Tris 缓冲液)
0.04 mol/L 柠檬酸钠/0.02 mol/L 氯化钠 pH 6.0 及 pH 5.0 (替换柠檬酸盐缓冲液)
0.04 mol/L 柠檬酸钠/0.02 mol/L 氯化钠 pH 4.0 (替换乙酸盐缓冲液)
0.04 mol/L 柠檬酸钠/0.02 mol/L 氯化钠 pH 3.2 (替换甘氨酸•Cl 缓冲液)
当所希望制备的抗体不能与葡萄球菌蛋白A有效地结合时(如IgM和一些IgG1抗体),可以用亲和层析柱来进行制备,柱子装填的介质是偶联上蛋白抗原或者抗鼠Ig的CNBr活化葡聚糖。这种抗原-葡聚糖将用于分离特异性的抗体,而抗鼠 Ig-葡聚糖用于分离所有的鼠免疫球蛋白。
2)将葡聚糖凝胶转移至 50 mL 锥形塑料离心管中,加 50-100 mg 的配体(2-5 mg/mL), 混匀后置摇动平台 4℃ 过夜。250 g离心 10 min, 弃上清。
3)加偶联缓冲液至满管,离心,弃上清。
4)加 20-40mL 1 mol/L pH 8.0 的乙醇胺,置摇动平台 4℃ 4-5 h, 离心,弃上清。
5)在管中依次加满 PBS 和洗涤缓冲液洗涤,每次洗后离心。
6)将葡聚糖凝胶转移到一个2.5 cm 的玻璃柱中,用 100 mL 的 PBS 平衡。
7)腹水液稀释于 3 倍体积的 PBS 后上柱,流速为 1-5 mL/min,在室温下操作。
用 30 mL的 PBS 从柱子上洗去未结合的蛋白质。
8)用甘氨酸•Cl 缓冲液洗脱结合蛋白质,分析、浓缩
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精编分子生物学实验指南 (第五版
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