氨基酸代谢标记实验

在含有放射性标记氨基酸的培养基中，短期培养细胞（<30min）对蛋白质进行脉冲标记。

1. 室温融化 [³⁵S] 标记甲硫氨酸，并用预热的（37℃）脉冲标记培养基制备 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。

2. 室温下 300 g 离心 5 min，获得悬液中 0.5 × 10⁷~2 × 10⁷ 细胞。用 10 ml 预热的脉冲标记培养基洗细胞。室温下 300 g 离心 5 min, 吸弃上清。轻柔敲打试管底部使细胞重悬并再洗一次。

3. 用预热脉冲标记的培养基重悬细胞，使其浓度为 5 × 10⁶/ml。在 37℃ 水浴中温育 15 min 以去掉细胞内的甲硫氨酸。定时颠倒试管来使细胞重悬。

4. 室温下 300 g 离心 5 min，吸弃上清。用 2 ml [³⁵S] 标记甲硫氨酸的工作溶液（见步骤 1）重悬细胞，转移至干净 15 ml 离心管中。盖紧盖子。在 37℃ 水浴中温育 10~30 min, 不时轻柔颠倒试管或振荡使细胞重悬。

5. 4℃、300 g 离心 5 min，吸弃上清。用 10 ml 冰预冷的 PBS 轻柔重悬并再次离心。

6. 可选：通过三氯乙酸（TCA）沉淀来测定标记物的掺入量（见辅助方案）。

7. 如果细胞沉淀不马上使用的话，可以置于冰上几小时或 80℃ 保存几天。分析前冰上融化细胞沉淀。

1. 在标记过程中，挥发性的含有[³⁵S]标记的化合物可能会释放，含有[³⁵S]标记甲硫氨 酸的培养基应保存在密闭紧盖的试管中，用前置于37°C水浴。在37°C不能超过60 min。

2. 在大多数情况下，冷冻细胞不会影响蛋白质的生物化学特性，但是在用去污剂溶解后再冻融细胞 抽提物可引起多亚单位复合物的解离或标记蛋白质降解。

1. 实验材料中的细胞悬液可以选择如 Jurkat、RBL、K562、BW5147、T 和 B 细胞杂交瘤等，要求是生长于潮湿、37℃、5% 032温箱中或从组织中制备（如淋巴细胞）。

2. 脉冲标记不会使培养基中的标记物完全丧失，因此标记混合物可以重复使用。收集标记的培养 基，小心地用0.45 μm的滤器滤过。细胞标记前后通过闪烁记数标记混合物来估计未掺人放射活 性的百分比。-20°C冷冻条件下标记的混合物可以保存2个月。

1. 在 100 mm 组织培养皿中培养细胞到 80%~90% 融合（0.5 × 10⁷~2 × 10⁷ 细胞，取决于细胞类型）。

2. 如上所述制备 [³⁵S] 甲硫氨酸的工作液体（见基本方案步骤 1）。

3. 吸弃上清并用 10 ml 预热（37℃）脉冲标记培养基轻柔洗细胞 2 次，弃掉洗液。

4. 加 5 ml 预热脉冲标记培养基，在潮湿、37℃、5% CO2 培养箱内孵育 15 min，以除去细胞内的甲硫氨酸。

5. 弃掉细胞上的培养基，加入 2 ml [³⁵S] 甲硫氨酸的工作液体（见步骤 2），在 CO2 培养箱内孵育 10~30 min。

6. 弃掉细胞上的培养基。用 10 ml 冷冻的 PBS 洗细胞并弃掉 PBS。加 10 ml 冷冻的 PBS，并用塑料刮子或橡胶细胞刮小心刮取收集细胞。

7. 转移悬液到 15 ml 离心管中，4℃，300 g 离心 5 min，弃上清。如果在标记过程中细胞明显脱落，有必要将含有 [³⁵S] 甲硫氨酸的工作液中的细胞小心刮取，并将悬液转移到 15 ml 离心管中，在用 PBS 洗涤前离心。

8. 可选：通过 TCA 沉淀法测定标记掺入的量（见辅助方案）。

如果在标记过程中细胞明显脱落，有必要将含有[35S]甲硫氨酸的工作液中的细胞小心刮取， 并将悬液转移到15 ml离心管中，在用PBS洗涤前离心。

１. 实验材料中贴壁细胞，如 HeLa、NRK、Ml、COS - 1、CV - 1，或原代培养的成纤维细胞或内皮细胞。

２. 如果细胞沉淀不马上使用的话，见基本方案步骤7。

1. 每个时间点和每个样品准备 0.5 × 10⁷ ~2 × 10⁷ 细胞， 每 0 .5 × 10⁷ ~2 × 10⁷ 细胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [³⁵S] 甲硫氨酸脉冲标记 10~30 min （见基本方案步骤 1~4，或见备择方案 1 步骤 1~5）。

2. 去除 [³⁵S] 甲硫氨酸的工作溶液，用 10 ml 37℃ 的示踪培养基洗一次，并加入 10 ml 37℃ 的示踪培养基。

3. 37℃ 培养到预期时间。拧紧试管盖子在旋转情况下培养细胞悬液。在 032 培养箱里孵育贴壁细胞。

4. 刮取贴壁细胞并转移到 15 ml 离心管。收集刮取的细胞或细胞悬浮液于 4℃ 300 g 离心 5 min。

5. 可选：通过 TCA 沉淀法测定标记掺入的量（见辅助方案）。

1. 将2倍体积含有过量未标记甲硫氨酸（15mg/L）的示踪培养基直接加入到标记混合物中，能够快速终止标记反应。

2. 示踪≤2 h，细胞悬液的最终浓度应该是 2 × 10⁶ 细胞/ml，或示踪>2 h，用 0.5 × 10⁶ 细胞/ml。 对贴壁细胞而言，加 10 ml/100 mm 平皿。

1. 上清可以弃掉，也可以收集起来用于分析分泌或脱落到培养基中的蛋白质。

2. 如果细胞沉淀不马上使用的话，见基本方案步骤7。

长期标记意味着对细胞进行 6～32 h 持续的代谢标记。该方法特别适用于研究合成速度相对较慢的蛋白质或研究成熟的标记蛋白而不是生物合成的前体。稳定状态的标记是长期标记的一种形式，在此过程细胞和放射性标记的氨基酸一起孵育直至放射性标记蛋白的合成和降解速率相当。如果蛋白质复合体中的亚基的初级结构已知，该方法可以对这些亚单位进行化学计量。所加入的未标记的甲硫氨酸量依赖于某些因素，如标记的时间和细胞浓度。通常使用的培养基中含有 5％～20％ 正常的非标记甲硫氨酸含量。

1. 在预热的 37℃ 长期标记培养基中制备 0.02～0.1 mCi/ml [³⁵S] 甲硫氨酸工作溶液（见基本方案步骤 1）。

2.1 对于悬浮细胞：用预热的长期标记培养基准备并洗细胞一次（见基本方案步骤 2）。

在 25 ml 0.02～0.1 mCi/ml [³⁵S] 甲硫氨酸工作溶液中重悬 0.5 ×10⁷～2 ×10⁷ 细胞，并转移到 75 cm² 组织培养瓶中。

2.2 对贴壁细胞： 75 cm² 组织培养瓶中生长 0.5 ×10⁷ ～2 ×10⁷ 的贴壁细胞（80% ～90%融合），在 CO₂ 培养箱中。用预热的长期标记培养基洗细胞一次（见备择方案 1 步骤 3）。每个 75 cm² 组织培养瓶中加入 25 ml 0.02～0.1 mCi/ml [³⁵S] 甲硫氨酸工作溶液。

3. 拧紧盖子以防 [³⁵S] 标记的化合物挥发。在 CO₂ 培养箱内培养 16 h。

4. 洗细胞并测定掺入量（见基本方案步骤 5～7；或备择方案 1 步骤 6～8）

1. 加 10～20 μl 被标记的细胞悬液到 0.1 ml 0.1％（m/V）BSA/0.02％（m/V）NaN3 中，置于冰上。

2. 加 1 ml 冷冻的 10％（m/V）TCA 溶液。剧烈振荡混匀，在冰上孵育 30 min。

3. 在真空滤过装置内，滤过细胞悬液到 2.5 cm 玻璃微纤维滤膜上。

4. 用 5ml 冷冻 10％TCA 溶液洗膜 2 次，再用乙醇洗 2 次。空气干燥 30 min。

5. 在玻璃微纤维滤膜上点同样体积（见步骤 1，10～20 μl）的放射性标记的细胞悬液，在空气中干燥。

6. 转移滤膜到 20 ml 闪烁管里，加 5 ml 闪烁记数溶液，用闪烁记数仪测定放射活性。

7. 计算 TCA 沉淀标记（见步骤 4）与总放射活性的比值（见步骤 5）。

１. TCA 有强烈腐蚀性。在制备和操作 TCA 溶液时注意保护眼睛并避免皮肤接触。

2. 洗液应按照混合化学/放射性废弃物处理。根据安全规程进行处理。