标签: 蛋白质 定量 蛋白质纯化指南 第八章
蛋白质定量实验主要用于测定蛋白质含量。
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蛋白质分子中的芳香族氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基,其化学结构中的共轭双键,具有吸收紫外光的特性,吸收高峰在280 nm处,蛋白质溶液的吸光度(A280)与蛋白质含量成正比关系,可作为样品中蛋白质定量测定。该方法简便、灵敏、快速,且样品用量少且可回收,低浓度的盐类也不干扰测定,但测定的准确度比Lowry法低,这是由于对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基含量差异较大的蛋白质时有一定的差距。若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质,会出现较大的误差。
1. 测定液必须澄清,否则造成测定结果误差。
2. 由于蛋白质的紫外吸收高峰常因pH的改变而变化,故应用紫外吸收法时要注意溶液的pH,最好与制定标准曲线时的pH一致。
1.于分析前至少 30 min 将 15uL 2-巯基乙醇加人到 5 mL OPA 储存液中, 这一试剂可稳定维持一天。所有荧光样品和相关反应在所有时间内都需要避光。
2.蛋白质标准品 (0.2~10 ug/mL) 和未知浓度的待测样品在分析前需要调节 pH 至 8.0-10.5。将 10 检测样品与 1 00xLOPA 储存液 (含 2-巯基乙醇) 混合,于室温下孵育 15 min。
3.加入 3 mL 0.5mol/L 的 NaOH, 混勻。
4.在激发光为 340nm, 发射光为 440~455nm 处,于荧光比色皿内对荧光进行读数。
5.在检测的动态范围内蛋白质浓度和荧光之间的联系应该是线性的,可以用来估计未知样品的浓度。
相比基于吸光度的蛋白质定量分析方法,这 3 种染料都提供了更好的灵敏度和动态范围。由于染料在水溶液中的水溶性和稳定性更佳,所以 OPA 检测法普遍优于荧光胺检测法。
使用胺衍生试剂对蛋白质进行定量具有一定的局限性,因为该检测方法显示出很大的蛋白质与蛋白质间的变异性,其原因是蛋白质中赖氨酸残基的数量不同,同时它需要一个「匹配」的标准品。该检测方法易被缓冲液中含有的甘氨酸、胺、铵离子和许多生物缓冲液中常见的硫醇所干扰,因而限制了它的应用(表 8.1)。检测的重复性取决于反应的 pH、蛋白质样品是否含有残余的酸性物质等。例如,来自于沉淀操作的样品,可减少胺的衍生率 (Youetal.,1997)。
一种非共价的胺活性染料—Epicocconone,也可用于溶液中总蛋白质量的检测 (Sigma),这一方法的机制已有报道 (BellandKaruso,2003;Coghlanetal.,2005)。
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