连续测定是最方便的,一种测定给出反应速率,无需进一步的工作。有许多不同类型的连续测定。
1.分光光度法
在分光光度测定中,您可以通过测量测定溶液吸收的光量变化来跟踪反应过程。如果这种光在可见区域,您实际上可以看到测定颜色的变化,这称为比色测定。MTT测定,使用四唑染料作为底物的氧化还原测定法是比色测定法的一个例子。
通常使用UV光,因为常见的辅酶NADH和NADPH以其还原形式吸收UV光,但不以其氧化形式吸收。因此,使用NADH作为底物的氧化还原酶可以通过在消耗辅酶的情况下在340nm波长下的UV吸光度的降低来测定。[4]
2.直接偶联测定
使用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联测定己糖激酶。
即使当酶反应不会导致光的吸光度发生变化时,仍然可以通过使用偶联测定法对酶进行分光光度测定。这里,一次反应的产物用作另一种易于检测的反应的底物。
3.荧光
荧光是指分子在吸收不同波长的光后发出一种波长的光。荧光测定使用来自产物的底物荧光的差异来测量酶反应。这些测定通常比分光光度测定更灵敏,但是可能遭受杂质引起的干扰以及当暴露于光时许多荧光化合物的不稳定性。
这些测定的一个例子是核苷酸辅酶NADH和NADPH的使用。这里,还原形式是荧光的,氧化形式是非荧光的。因此,氧化反应之后可以通过增加来减少荧光和还原反应。也可获得在酶催化反应中释放荧光染料的合成底物,例如用于测定β-半乳糖苷酶的4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷。
4.量热
量热法是测量化学反应释放或吸收的热量。这些测定非常通用,因为许多反应涉及一些热变化并且使用微量热计,不需要太多的酶或底物。这些测定可用于测量不可能以任何其他方式进行测定的反应。
5.化学发光
化学发光是通过化学反应发光。一些酶反应产生光,这可以测量以检测产物形成。这些类型的测定可以是非常敏感的,因为产生的光可以在数天或数周内被照相胶片捕获,但是可能难以量化,因为不会检测到反应释放的所有光。
通过酶化学发光(ECL)检测辣根过氧化物酶是在蛋白质印迹中检测抗体的常用方法。另一个例子是酶萤光素酶,这种萤光素酶存在于萤火虫中并且自然地从其底物荧光素产生光。
6.光散射
静态光散射测量重均摩尔质量和溶液中大分子浓度的乘积。给定在测量时间内一种或多种物质的固定总浓度,散射信号是溶液的重均摩尔质量的直接量度,其随着络合物形成或离解而变化。因此,测量量化了复合物的化学计量以及动力学。蛋白质动力学的光散射测定是非常通用的技术,其不需要酶。
7.微尺度热泳
微尺度热泳(MST)测量平衡时分子/底物的大小,电荷和水合熵。荧光标记的底物的热泳运动在被酶修饰时发生显着变化。可以以高时间分辨率实时测量该酶活性。]全光学MST方法的材料消耗非常低,仅需要5μl样品体积和10nM酶浓度来测量活性和抑制的酶速率常数。MST允许分析人员一次测量两种不同基板的修改(多路复用))如果两种底物都用不同的荧光团标记。因此可以进行基质竞争实验。
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