实验步骤 | |
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实验步骤 |
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实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
一、酵母 DNA 微量制备(40 ml)1.在 125 ml 三角瓶中用 40 mlYPD 培养液在 30°C 条件下培养细胞达最大生长量(过夜)。 2.将上述培养物移入螺盖离心管,用医用离心机或 SarvallSS-34 转头以 5000r/mm 离心 5 min,弃去上清液。 3.将细胞悬浮在 3 ml 的 0.9mol/L 山梨醇-0.lmol/LNa2EDTA(pH7.5) 溶液中。 4.加 0.lml 的 2.5 mg/ml 消解酶 100T,置 37°C 保温 lh。 5.用医用离心机或 SorvallSS-34 转头以 5000r/min 离心 5 min,弃去上清液。 6.将细胞重悬于 5 ml 的 50 mmol/LTris-HC1(pH7.4)-20 mmol/LNa2EDTA 溶液中。 7.加 0.5 ml 的 10% SDS,混匀。 8.置 65°C 保温 30 min。 9.加 1.5 ml 的 5mol/L 乙酸钾溶液,在冰浴中放置 lh。 10.用 SorvallSS~34 转头以 10000r/min 离心 lOmin。 11.将上清液转移至干净的塑料离心管中,室温下加入两倍体积的 95% 乙醇,混勻,以 5000?6000r/min 室温离心 15 min。 12.弃上清液,将沉淀物干燥,然后悬浮在 3 mlTE 缓冲液(PH7.4) 中,此操作可能需要几个小时。 13.用 SorvallSS-34 转头以 10000r/mm 离心 15 min,将上清液转移到一个新试管,弃沉淀物。 14.加入 150jul 的 lmg/irilRNaseA 溶液,在 37°C 下保温 30 mino 15.加入一倍体积的 100% 异丙醇,轻轻混匀。取出呈松散纤维状的沉淀物,无需离心,让其自然干燥。 16.将沉淀物悬浮在 0.5 mlTE 缓冲液(pH7.4) 中,置 4°C 保存。酵母 DNA 的终浓度大约在 ZOOjug/ml。如果最后的溶液不澄清,用异丙醇再次沉淀 DNA 或用 SorvallSS-34 转头以 10000r/min 离心 15 min。 二、酵母 DNA 微量制备(5 ml)1.接种酵母于 5 ml YPD 中,置 30°C 培养过夜。 2.用医用离心机以 2000r/min 离心 5 min 沉淀细胞,弃上清液。 3.将细胞悬浮在0.5 ml 的 lmol/L 山梨醇-0.lmol/LNa2EDTA(pH7.5) 缓冲液中,并转到一支 1.5 ml 离心管中。 4.加入 0.02 ml 的 2.5 mg/ml 的消解酶 100T 溶液,置 37°C 保温 lh。 5.离心 lmin。 6.弃上清液,把细胞用 0.5 ml 的 50 mmol/LTrls-Ha(pH7.4)-20 mmol/LNa2EDTA 溶液悬浮。 7.加 0.05 ml 的 10%SDS,混匀。 8.置 65°C 保温混合物 30 min。 9.加 0.2 ml 的 5mol/L 乙酸钾,把离心管在冰浴中放置 lh。 10.离心 5 min 。 11.将上清液转移到一洁净微型离心管,室温下加入等体积的无水异丙醇,混匀,放置 5 min。短暂离心(10s) 弃上清液,让沉淀自然干燥。 12.用 0.3 mlTE 缓冲液(pH7.4) 重新悬浮沉淀。 13.加 15ul 的 lmg/ml 的 RNaseA 溶液,置 37°C 保温 30 min(此步可任意选择)。 14.加 0.03 ml 的 3mol/L 乙酸钠,混匀,用 0.2 ml 的无水异丙醇沉淀,再短暂离心收集 DNA。 15.弃上清液,自然干燥,用 0.1~0.3 ml TE 缓冲液(pH7.4) 重新悬浮 DNA。 16.在使用限制性内切酶酶解 DNA 之前,有必要将最终溶液离心较长时间(15 min) 以便除去可能抑制酶解的不溶性物质。 三、10 min 制备酵母 DNA大肠杆菌或酵母转化质粒的制备1.在质粒 DNA 选择性培养基(如 SC-ura) 中,置 30°C 培养少量培养物(至少 1.4 ml) 过夜。 2.将培养物转人一支 1.5 ml 的微型离心管,离心 5s,收集细胞。 3.小心倾去上清液,轻弹离心管,使沉淀重新悬浮于残余培养液中。 4.加人 0.2 ml 的 2%TritonX-100,1%SDS,100 mmol/LNaCl,10 mmol/LTris-HCl(pH8),lmmol/LNa2EDTA; 加入 0.2 ml 的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1); 加人0.3 g 酸洗过的玻璃珠。 5.振荡 2 min。 6.离心 5 min。 7.用 1~5ul 含 DNA 的水相转化 0.2 ml 的大肠杆菌受体菌,用 15W 水相转化酵母菌。 用于 Southern 分析的基因组 DNA 分离1.用 YPD 培养基,置 30°C 培养 10 ml 酵母至最大生长量。 2.用医用离心机离心 2 mm,弃上清液,收集细胞,用 0.5 ml 蒸馏水重新悬浮,将细胞转入 1.5 ml 微型离心管中,离心 5s 收集细胞。 3.重复第 2) 步。 4.重复第 2) 步。 5.加 0.2 mlTE 缓冲液(pH8),振荡 3~4 min。 6.离心 5 mm,将水相移至洁净试管,加 lml 的无水乙醇,上下颠倒,混合均匀。 7.离心 2 min,弃上清液,悬浮在 0.4 ml TE 缓冲液和 3ul 的 10 mg/ml RNase A 溶液,置 37°C 保温 5 mm, 加入 10;ul 4 mol/L 乙酸铵和 lml 的无水乙醇,上下颠倒,混合均匀。 8.离心 2 min,弃上清液,自然干燥后,用 50ul 的 TE 缓冲液悬浮,每份样品用 lOul 进行 Southern 印迹分析,每份用量 2~4ug DNA。 四、制备酵母基因组 DNA: 玻璃珠法1.用 5 ml 培养基(完全培养基或选择性培养基)在 30°C 下,摇床培养过夜。 2.转移培养物至 13 mmX100 mm 的玻璃离心管中,用台式离心机以 1500r/min 离心 5 min,收集细胞。 3.用 3 ml 无菌水洗细胞,同上离心。 4.用 500ul 裂解缓冲液再次悬浮。 5.加入干净的玻璃珠(约 1.5 ml 离心管的 2/3 体积)和 25ul的 5mol/L Naa。 6.以最高速振荡 lmin。 7.以 2000r/min 离心 2 min。 8.用 P-1000 移液器转移上清液至 1 支 1.5 ml 离心管。 9.加入 500ul 苯酰,振荡,离心 lmin。用 P-1000 移液器吸取水相(上层),转移至洁净离心管,加入 500ul SEVAG(氯仿:异戊醇,24:1),同上振荡,离心,抽提。 10.加人 lml 预冷的 95% 乙醇,在 -20°C 下沉淀 lh。 11.以最高转速离心 5 min 沉淀 DNA,弃上清液,用 70% 乙醇清洗,最后悬浮在 250ul TE 缓冲液中。 12.加的 EDTA-Sark 和 5ul 的蛋白酶 K(10 mg/ml),至 37°C 保温 30 min。 13.加 250ul 5mol/L 乙酸铵,重复 9)、10) 步骤。 14.收集 DNA,用 70% 乙醇洗,悬浮于 100ul 的 TE 缓冲液(每个酶解反应使用约 10ul)。
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试剂、试剂盒 | |
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实验步骤 | 1.从液体培养物中或用细菌接种环在平板表面刮菌,收集大约 2.5 OD的细胞量(大约 2.3 mg 湿重)。将细胞重悬于 100ul 蒸馏水中,加入 100ul O.2mol/L NaOH,将样品室温放置 5 min。 2.离心沉淀样品,并将其重悬于 50ul PAGE 样品缓冲液中。将样品于沸水中煮 3 min 并再次离心沉淀。用移液器吸取含有蛋白质的上清,每个泳道用 6ul 上清上样,在小型凝胶上电泳分离蛋白质。 3.若要用 Bradford 法测蛋白质浓度,则将样品以 1:3000 稀释。 |
试剂、试剂盒 | |
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实验步骤 | 1.培养 3~6L 细胞至浓度为 2X107~3X107 个/ml(OD50=1.0~1.3)。 2.离心收集细胞,并用冰预冷的水洗一次。 3.用冰预冷的 NP-40 缓冲液再洗一次后,转移到 50 ml 的离心管中。 4.离心收集细胞,用 10 ml NP-40 缓冲液重新悬浮细胞。 5.向干冰预冷的研磨杵和臼中加入液氮。在液氮挥发时,逐滴往磨臼内加入细胞。并注意添加液氮以保持细胞的冷冻状态。用力碾磨细胞 15 min。注意防止细胞的融化。 6.转移处理好的裂解物到冰预冷的烧杯,并让其在室温中融化。当边缘开始融化时,加人 20 ml 含有蛋白酶抑制剂的 NP-40 缓冲液(通常混合使用几种商业化的蛋白酶抑制剂)。 7.转移预处理好的裂解液到 40 ml 的 Nalgene 离心管中,用 SA-600 或类似型号的转头在 16500r/min 高速离心。 8.加入 1ml 琼脂糖 6B(Sigma) 的珠子(与 NP-40 缓冲液按 1:1 混合)。4°C 旋转摇动 30 mm。离心收集珠子。转移上清液到一个新的 50 mlFalcon 离心管。 9.加入 400ul 用 NP-40 缓冲液预洗过的琼脂糖 6Fast Flow IgG(Amersham),并在 4°C 旋转摇动至少 2 h。 10.旋转摇动好的产物倒人 Poly-Prep(BioRad) 层析柱。自然重力压紧。 11.30 ml NP-40 缓冲液洗柱子一次。 12.10 ml TEVC 缓冲液再洗一次。 13.将层析柱装回收集管中,加人 lmlTEVC 缓冲液和 5 叫 TEV(tobaccoetchvirus) 蛋白酶。拧紧盖后,4°C 旋转摇动 2 h 至过夜。 14.吸取洗脱液并转移到一个封住底部的新层析柱中。 15.1.0 ml TEVC 缓冲液洗旧层析柱。 16.加 3 ml CBB(钙调蛋白结合缓冲液)到 TEV 上清液中,再在每毫升 TEV 洗脱液中加人 3ul 1 mol/L CaCl2。加 300jul 雀丐调蛋白结合珠子(Amersham) 于 CBB 中,珠子与缓冲液 1:1 混合后,4°C 平摇孵育 lh。 17.洗涤: A.1ml CBB(0.1%NP-40) 洗 2 次 B.1ml CBB(0.02%NP-40) 洗 1 次 18.堵住层析柱底部,加入 1ml CEB(钙调蛋白洗脱缓冲液)。 19.收集第一部分 1ml 洗脱液到微量离心管中。 20.堵住层析柱底部,加人 lmlCEB。 21.收集第二部分 lml 洗脱液到微量离心管中。 22.合并两次收集液,分装成 50(VU750|ul,750/zl 三份到未硅化的微量离心管中。 23.用 100%TCA 溶液配制 25%TCA,冰浴 30 mm,间或振荡。 24.用最大转速(13000r/min),4°C 离心 30 min。 25.用冰冷(一 20°C) 丙酮(含 0.05mol/L HCl) 洗一次后,在 4°C 下,最大转速离心、5 min。 26.用冰冷(一 20°C) 丙酮洗一次后,在 4°C 下,最大转速离心 5 min。 27.除去上清,真空干燥约 lOmin。 用 500ul 部分做 10% 的胶电泳银染。用 750ul 部分做质谱分析。 |
试剂、试剂盒 | |
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仪器、耗材 | |
实验步骤 |
大量 RNA 分离程序酵母总 RNA 的分离1.在每毫升培养物中加入 50ug 环乙酰亚胺,在 30°C 下摇晃 15 min。此步骤亦可省略,但是有人认为此步可防止 mRNA 凝集在多聚核糖体上。 2.迅速冷却收集细胞,在大离心瓶(Sorvall GS 或类似型号)中加入约一半体积的碎冰,将培养物倒入至盖过冰面,振荡,4°C,5000r/min 离心 5 min。 3.加人 llg 酸洗过的玻璃珠于 30 ml 离心管中,以 Corex 玻璃离心管为最佳,塑料离心管也能使用。 4.加入 3 ml 已用 LETS 缓冲液平衡的苯酚到玻璃珠中。 5.用 2.5 ml 冰预冷的 LETS 缓冲液悬浮细胞,并将其加入到上述玻璃珠/苯酚管中,为了使细胞达到最好的破碎效果,液面应刚好高于玻璃珠表面。 6.最高速振荡 30s 后,在冰上放置 30s,如此交替进行 3 min。用相差显微镜检测细胞破碎情况,破碎的细胞呈现无折射的空细胞形态。 7.当至少 90% 细胞破碎后,加5 ml 冰预冷的 LETS 缓冲液,轻微振荡,用 SorvallSS-34 转头以 8000r/min 离心 5 min,使溶液分相。离心后,酚层和蛋白质界面应刚好低于玻珠表面,以便容易地吸出水相而不会扰动界面。 8.将水相转到一个干净离心管,用 5 ml 苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 抽提 2 次,避免带人界面。如需要,可用氯仿再抽提一次。 9.加入 1/10 体积的 5mol/L 氯化锂,在一 20°C 下沉淀 3 h。RNA 沉淀可保存在该温度下。 Poly(A)RNA 的分离1.将保存的 RNA 用 SorvallSS-34 转头以 10000r/min 离心 lOmin,收集 RNA 沉淀,用 80% 乙醇洗涤。真空干燥后,溶于 2.5 ml 蒸馏水中。完全溶解后,加入 2.5 ml 2X 上样缓冲液,同时加 SDS 至终浓度为 0.3%。 2.65°C 加热 5 min。 3.将样品加到一个 oligo(dT) 柱,用 1 X 上样缓冲液洗 3 次。 4.用 10mmol/L HEPES (pH7) 洗脱 Poly(A)+RNA。如果希望得到更满意的结果,可以加人 RNase 抑制剂。 5.用蒸馏水对 Poly(A)+RNA 进行 10 倍稀释,通过 OD26Q 的光吸收测定 RNA 浓度。 用水将 10 mmol/LHEPES(pH7) 稀释 10 倍(lmmol/LHEPES) 作为对照。 6.加 1/10 体积 3md/L 乙酸钠和 2.5 倍体积无水乙醇沉淀 RNA,上下倒置混匀,在一 70°C 下放置 30 min。离心 lOmin,弃上清液。用蒸馏水溶解 RNA 沉淀使终浓度为 lmg/ml。无论是溶解的 RNA 或是乙醇沉淀的 RNA 都能在一 70 〇 C 下长期保存 快速小量 RNA 的分离1.将 7.5X107 个细胞的过夜培养物接种于 50 ml YPD 培养基。 2.在适当的温度和转速下培养细胞到要求的浓度。在收集细胞之前可转移到不同的温度。细胞密度不应超过 1.5X107 个/ml 或者 00_值不超过 1.5。计算细胞密度有利于后期比较相对的 RNA 表达水平。(附录 G,用标准血球计数板进行酵母细胞计数) 3.4°C 下,3000 g 离心 3 mm 收集细胞。弃上清后,用 1ml 预冷的 AE 缓冲液重悬细胞。迅速转移细胞到一个离心管中,16000 g,离心 10s。弃上清,再用 lml 预冷的 AE 缓冲液重悬细胞,重复此步骤。
4.用 4004 预冷的 AE 缓冲液重悬细胞,并加入 40ul 10% 的 SDS 充分混匀。再加入 440^1 预先用 AE 缓冲液平衡的苯酚溶液 (pH5.2) 充分混匀。 5.准备干冰/95% 乙醇浴:干冰压成粉末后,缓慢加到 95% 的乙醇中,直到乙醇溶液呈厚糊状为止。 6.在该干冰/95% 乙醇浴上快速冷冻细胞 5 min 后,将细胞转移到 65°C 水浴 5 min。振荡裂解物 30s 并重复该冻融振荡过程。 7.再次在干冰/95% 乙醇浴上快速冷冻细胞 5 min。 8.裂解物在室温下 16000 g 离心 7 min。如果有机相和水相不能完全分层(有大量白色绒毛状悬浮物),则再在 16000 g 离心 5 min。若仍然不能有效分层,则补加 10ul 预冷的 AE 缓冲液和 100ul 苯酚(pH5.2) 后,再在室温下 16000 g 离心 5 min。转移水层到一个新的离心管。 9.加入 600ul 酚(pH5.2)-氯仿-异戊醇(25:24:1) 抽提,混悬振荡后,室温下 16OOOg 离心 5 min。转移水层到新离心管。 10.加入 50ul 3mol/L 乙酸钠(pH5.2) 和 1ml 预冷的无水乙醇以沉淀 RNA。-20°C 冷冻 RNA 20 min。RNA 可在无乙酸钠的无水乙醇中保存于 -70°C 备用。 11.4°C 下,16000 g 离心 15 min。弃尽上清,并用 1ml 预冷的 80% 的乙醇洗一次。16000 g 离心 15 min,弃尽上清(移除所有的液体以减少盐污染)。真空离心干燥 RNA(5~10min) 并用 100ul 双蒸水重悬。 12) 以 260nm 和 280nm 的吸收值来确定 RNA 浓度和纯度。OD260/280值在 1.7~2.0 表明 RNA 的纯度为可接受的。labs. 单位=38ug RNA。RNA 产量一般在 50~200ug。 注意:上述方法中所涉及的容器都必须用 RNaseAway(LPS) 预洗后 160°C 干烤 24 h。所有的水试剂在灭菌前都必须按 1:1000(V/V) 的比例加入焦碳酸二乙酯以灭活 RNA 酶。
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试剂、试剂盒 | |
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实验步骤 | 1.临用之前制备羟胺溶液,置冰上待用。 2.将用 CsCl 纯化的 10 埤质粒 DNA 加到含 500ul 羟胺溶液的微量离心管中。 3.在 37°C 下温育 20 h。 4.加人 10ul 的 5mol/L NaCl,50 ul 1mg/ml 的牛血清白蛋白(BSA) 和 1ml 无水乙醇以终止反应,置 -70°C 10 min 以沉淀 DNA。 5.离心 10min,小心倾其所有上清液。 6.重悬 DNA 于 100ul TE 缓冲液(pH8) 中,再加人 10ul 3mol/L 的乙酸钠和 250ul 的无水乙醇,在 -70°C 下放置 10min,重复步骤 5。 7.让沉淀自然干燥,重悬于 100ul TE 缓冲液(pH8)。 8.该 DNA 可直接用于大肠杆菌或酵母的转化。相对于非诱变 DNA,已诱变 DNA 在酵母中的转化效率降低了 3/4。Ura-质粒在大肠杆菌中可被检出。大肠杆菌菌株可以是 wng+,但其转化效率将降低至原来的 1/10~1/100。当转化大肠杆菌菌株(DB6507) 时,如果 URA3 基因约占整个质粒 DNA 的 10%,有望获得约 4% 的 Ura-菌落。用同样的诱变 DNA 母液转化酵母,将得到约 1% 丧失功能的突变 (敲除)。约有 10% 的突变体是温度敏感型的。 |
实验步骤 | |
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实验步骤 |
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实验步骤 |
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试剂、试剂盒 | |
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实验步骤 | 鬼笔环肽专一性地结合 F 肌动蛋白,荧光标记的鬼笔环肽染细胞与肌动蛋白抗体的染色模式类似。 1.在 500 ml 三角瓶中振荡培养 25 ml 酵母菌至密度为 2X107 个/ml。 2.添加 17 ml 10% 甲醛(EM 电子显微级)到培养基中至终浓度 4%,在酵母菌生长温度下固定细胞 10 min。 3.2000~3000r/min 离心 5 min,收集细胞。 4.在 6 ml 加了 4 ml 10% 甲醛(EM 级)的 PBS 溶液中室温固定细胞 lh。 5.用 10 ml PBS 洗细胞两次,重悬在 500ul PBS 中。 6.取 180ul 细胞悬液,添加 20ul 罗丹明鬼笔环肽或荧光素鬼笔环肽。避光温育 lh,每融 15 mm 轻轻混合。 7.用 1ml PBS 洗细胞 5 次。 8.悬浮细胞在约 200ul 免疫荧光固定液中。放置于 -20°C,染色细胞可以保存几个月。 9.观察细胞时,滴 1ul 细胞悬液在盖玻片下,通过毛细管作用细胞液能铺满玻片。确保玻片清洁。 |
实验步骤 | |
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实验步骤 |
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实验步骤 |
1.从培养瓶中取 1 ml 细胞培养物,置于微量离心管中。如果有必要,稀释细胞至OD660<1。 2.超声细胞确保细胞计数准确,转移细胞到测量杯中。用细胞生长培养基作为空白对照,在测量样品前将吸光度调零。 3.测量每个样品的 OD660。 4.按照表 16.1 的方法计算单倍体细胞密度,二倍体细胞的密度是单倍体细胞密度的一半。
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实验步骤 | |
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试剂、试剂盒 | |
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仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1.培养要分析的细胞。每一个样品,需要在三角瓶中培养 50~100ml 细胞至 OD600 大约为 1。 2.甲醛处理细胞交联蛋白质和 DNA。加甲醛到细胞中至终浓度为 1%(37% 的甲醛按 1:36 与细胞悬液混合),在室温维持 10~120 min,期间颠倒几次。 >注意:最佳的固定时间对不同的蛋白质是不同的,对于不同的分析要加以优化。 3.制备加有蛋白酶抑制剂的裂解/免疫沉淀缓冲液。使用 5~8 ml 裂解/免疫沉淀缓冲液 (用量根据需要而变化,详见程序 6 和 7) 来收集每个染色质免疫沉淀样品。lml 裂解/免疫沉淀缓冲液加 20ul 50 倍的蛋白酶抑制剂储存液。将缓冲液储存在冷室中。 >注意:PMSF 最好使用时加入,因其在水相中不稳定,pH 8 时的半衰期约 35 min。每毫升反应缓冲液中加入 20 一 50 倍浓度的蛋白质抑制剂储存液。 4.停止交联反应。加入 2.5mol/L 的甘氨酸至终浓度为 125 mmol/L,室温温育样品 5 min 停止交联反应。 5.用 TBS 洗细胞三次。转移样品到 GSA 瓶或 50 ml 聚丙烯管中,收集并清洗细胞。用冰冷的 TBS 洗三次,前两次用 20 mlTBS 洗,最后一次用少量洗。最后一次洗应该使用 50 ml 管,尽可能去净 TBS 以便裂解。 6.加玻璃珠裂解细胞。 A. 重悬细胞在裂解/免疫沉淀缓冲液中。在 50 ml 管中用 25ul 冰冷的裂解/免疫沉淀缓冲液重悬细胞。 B. 加玻璃珠(0.5 mm) 振荡细胞。加 3~6 ml 玻璃珠至重悬细胞(细胞量为 1X109~2X109 个),用旋涡振荡器以最髙速振荡细胞。在最初混合裂解物和玻璃珠之后,添加足够的玻璃珠在混合物中以达到混合物中含有将近 1 ml 的干玻璃珠。这可能需要 1~2 ml 的玻璃珠。在液体相对少的情况下,玻璃珠的研磨作用最好。振荡每个样品 6~8 次,每次 30s,或 4、5 次,每次 1min。最好在冷室中完成该步操作。如果在室温操作,最好间隔地把样品置于冰上冷冻。 >注意:在显微镜下检测细胞是否有效裂解。如果裂解不完全,视需要重复振荡程序。 7.收集细胞粗裂解物。加 2~3 ml 新鲜的裂解/免疫沉淀缓冲液,从玻璃珠子上洗净细胞粗裂解物。收集粗裂解物到一个 15 ml 有盖的试管中。为了收集裂解物,使用 lml 自动移液器,将移液管尖伸入管底吸取裂解物。反复吸几次,尽可能吸干净裂解物。 由于玻璃珠的吸附作用,吸取的裂解物总体积会少于添加时的体积。不用担心吸走少量玻璃珠,在后面的步骤中残存的玻璃珠会被去除。 >注意:在吸取样品或超声破碎时,不要交叉污染各裂解样品,因为此后的 PCR 扩增是很灵敏的。 8.超声粗裂解物剪切染色质。用超声波处理上清 3 次,每次 12~15s,剪切样品中的染色质。使用 Branson250 超声器,用最小的探头,功率设为 3,100% 的有效循环。 在超声间隙,至少在冰上冷冻样品 2 min。超声后 DNA 的平均长度应为 500bp,分布在 100?lOOObp。 >注意:超声波处理后检测 DNA 片段的大小以确定有小的 DNA 片段。为了降低交叉污染,在每个样品超声波处理后仔细地清洁超声探头。 9.离心去除裂解物中的细胞碎片。在冷冻离心机中 5000r/min 离心几分钟,移去细胞碎片。转移上清到新的 15 ml Corex 离心管中进一步于 4°C 离心 5 min 后,吸去位于 10.75000 处的细胞碎片,并将上清转移到新管中。重复离心 10 min,再将上清转移到新管中。最终裂解物应该略呈乳白色。 >注意:在此步骤,可暂时将样品保存在 -80°C。 10.均化裂解物中的蛋白质的量。对每个裂解样进行总蛋白质定量。由于样品较浓,定量时需要作 10 倍的稀释。加裂解/免疫沉淀缓冲液调浓度,使每个样品的蛋白质浓度相同用于免疫沉淀。 11.移去总的染色质样。从各个样品中移出 50ul 样,加 20ul 的 TE/1%SDS。这就是总的染色质样。样品含有剪切的基因组 DNA,用来判断免疫沉淀之前的 DNA 的量。不要用这些样品做免疫沉淀,但是应该对它们进行与免疫沉淀的样品同样的操作,为控制 PCR 提供内参 DNA。 12.免疫沉淀选择的蛋白质。完成三步免疫沉淀,在每个免疫沉淀实验中使用细胞裂解液应该含有 30 mg 总蛋白质。 预清除:裂解物跟血清孵化除去非专一性结合的抗原。如果可以得到,使用免疫前的血清。若不能得到就使用标准血清。 一抗:添加适当量的抗体到裂解物中,4°C 温育一至几个小时。 无抗体免疫沉淀对照:对应每个一抗样品,做无抗体免疫沉淀对照。这个对照表明玻璃珠或其他因素对非专一性免疫沉淀的水平检测结果的影响。 二抗:添加 40ul 50% 抗体 A(兔抗)或抗体 G(鼠抗)琼脂糖珠。4°C 温育样品 lh。这是高亲和结合程序,延长时间不可能提高免疫沉淀效果。 13.为免疫沉淀后清洗准备含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液。在免疫沉淀后清洗的程序中,每个样品需要 2 ml 裂解缓冲液和 lml 裂解缓冲液/500 mmol/L NaCl。 14.洗涤免疫沉淀珠子。 A. 去除免疫沉淀上清。3000 r/min 离心 lmin 沉降珠子,去除上清。如有必要可以保存上清以备后面的分析。 B. 按以下程序洗免疫沉淀珠子。在每次清洗后,1000 g 转速振荡珠子 lmin(同步骤 13),用小枪头移除液体,避免吸到珠子。加 1ml 清洗溶液,室温洗 3~5 min,重复 3 次。每次洗后,3000r/min 离心去除洗液。清洗步骤如下: a.用裂解液洗两次 b.用裂解液/500 mmol/L NaCl 洗一次 c.用免疫沉淀洗脱液洗两次 d.最后用 TE 洗一次 15.用 TES 洗脱免疫沉淀样(TE/1%SDS) a.加100ul TES 在 65°C 温育 15 min,从抗体珠子上洗脱免疫共沉淀样。 b.13000r/min 离心,沉降珠子,将上清吸到一个新管子中。 c.再用 150ul TE/0.67%SDS 混合液洗脱一次,上清与第一次的合并。 d.离心上清,将清液转移到另一只新管子中,以去除残余的珠子。离心后,能合并上清 250ul,剩余约 10ul 与珠子一起残留在管底。 16.温育所有的样品逆转交联。在 68°C 温育洗脱样和总的染色质样,逆转交联。 17.用蛋白酶 K 处理样品。 a.加 TE 到样品中。交联逆转后,加 250ul TE 使总体积为 500ul。 b.加糖原和蛋白酶 K 到各样品中。加糖原 DNA 担体和 100 吨蛋白酶 K。 c.37°C 温育样品至少 2 h。 18.加氯化锂。加 55ul 4mol/L 的氯化锂到样品中。将使得 DNA 在步骤 22 中沉淀。 19.酚氯仿抽提样品。用酚氯仿抽提样品(酚:氯仿:异戊醇比例为 25:24:1) 两次。 20.DNA 沉淀。 a.加 lml 无水乙醇到各样品中混合一下。将样品放人冰箱将有利于沉淀(一般放于一 20°C 或一 70°C) 至少 15 min。 b.12000 g 0°C 离心 10min 沉降 DNA,但若 DNA 浓度过低,可适当延长离心时间。用 75% 乙醇洗沉淀,离心去上清,空气干燥沉淀。 21.RNase 处理样品:重悬沉淀在 25~50ul 含 10 ug RNaseA 的 TE 中,37°C 温育 lh。 22.PCR 分析各样品。使用专一性引物扩增靶 DNA。同时引入阴性对照。 |
试剂、试剂盒 | |
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实验步骤 | 1.生长和收集细胞。细胞生长至 5X106 个/ml,离心收集 10 ml 样品,并用 5 mlTE 缓冲液洗一次。再次离心收集并悬浮在 1.5 ml 水中。 2.乙醇固定细胞。每份 1.5 ml 样品中加人 3.5 ml 无水乙醇,使乙醇的终浓度达 70%。 在室温中放置 1h,如有必要,可在 4°C 放置样品。 3.洗去乙醇并超声波处理分散细胞。离心收集细胞并用 5 ml TE 缓冲液洗一次。超声波处理分散细胞(每次 5~10s,共 3 轮) 4.核酸酶处理细胞。Tris 缓冲液稀释核酸酶储存液至 1mg/ml(IX)。离心收集细胞,移去缓冲液并加入 2 ml IX 核酸酶溶液重新悬浮。37°C 振荡温育样品 lh,如有必要可 4°C 过夜。核酸酶消化充分十分关键,这一步可以通过在荧光显微镜下观察细胞来检测。细胞核因染色会非常明亮,而细胞质除线粒体 DNA 之外不会被染色。 5.胃蛋白酶处理细胞。离心收集细胞并用新鲜配制的 1~2 ml 胃蛋白酶溶液悬浮,室温温育样品 5 min。 6.SYTOX Green 染细胞,方法见 Haase 和 Reed(2002)。配制 SYTOX Green 的 TE 缓冲液(pH7.5),每 2.5 ml 的 50 mmol/LTE 缓冲液中加入 1ul SYTOX Green。每份样品加入0.5 ml 的 SYTOX Green 的 TE 缓冲液,使 SYTOX Green 终浓度为 1umol/L。 |
实验步骤 |
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实验步骤 | 1.培养酵母细胞过夜,使細胞密度达到 2X108 个/ml。 2.从同一培养物中转移两份 lml 的样品至离心管中,5000 g,离心 10s 收集细胞。 3.丢弃上清,用无菌蒸馏水悬浮细胞,再离心收集细胞。 4.重悬细胞在 1 ml 的无菌 0.1mol/L 磷酸钠中。 5.用血球记数板测定细胞密度。 6.向其中一离心管中加入 30^x1EMS 并剧烈振荡分散(另一管作为未诱变的对照)。两份样品在 30°C 温育 lh,不时晃动。 7.离心收集细胞,弃上清至 EMS 废液收集瓶中。重悬细胞在 200ul 的 5% 硫代硫酸钠溶液中,转移至新的离心管中并将使用过的离心管丢弃至 EMS 废液收集瓶中。 8.用 200|ul 的 5% 硫代硫酸钠溶液洗细胞两次(废液弃至 EMS 废液收集瓶中),重悬细胞在 lml 的无菌水中。 9.细胞可以直接涂布平板,但在有些情况下让细胞在选择培养基上生长之前先生长一段时间十分重要,这样能使细胞内的野生型蛋白能够被已诱变的蛋白取代。如果菌落形成后,切记 EMS 诱变处理会导致产生一致的菌落。 >注意:此方案会使大部分二倍体菌株 40%?70% 的细胞死亡,但是对诱变剂的敏感性是随菌株不同而变化的。在诱变过程中存活的细胞相对于未诱变的对照细胞通常突变频率会增加 102~103(Lindegren et al.1965),建议通过预实验校正 EMS 诱导的死亡率和突变频率。有一些简单的测试能够分析突变频率,也许最有效的方法就是分析 CAM 基因的功能缺失。CAM 基因功能缺失能使细胞对刀豆氨酸产生抗性(Whelan et aL 1979),因此可将 EMS 处理后和未处理的培养物涂布在含有刀豆氨酸的平板(附录 A) 上,从而分析对刀豆氨酸抗性的细胞。另一种方法就是检测因特定基因的失活而产生抗放线酮的细胞(Kaufer et al.1983)。放线酮抗性几乎都是由于 CYH2 基因的特异性颠换造成的,但是这种突变并不是全部因为诱变(如 EMS 诱变)所造成,因此这种方法并不普及。其他常用的分析诱变的方法是基于一个或多个基因的失活导致产生突变的表型,这包括产生对 5-FOA 的抗性(URA3,URA5 或其他可能涉及渗透性的基因;Boeke et al.1986),能在以 a-氨基乙二酸为唯一氮源的培养基上生长(LYS2 或 LYS5 基因功能缺失;Chattoo et al.1979) 以及产生红色的菌落(ADEI 或 ADE2 基因功能缺失;Jones and Fink 1982)。 |
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实验步骤 | 各种型号的显微操作平台所附带的显微针在四分体解剖、分离合子以及操作单个细胞都十分有用。显微针可以从商业公司购买。或者,将细的玻璃纤维粘在弯的玻璃毛细吸液管上,自己制作显微针,下面介绍两种方法: 方法一:显微针是用直径 2 mm 的玻璃丝在酒精喷灯上拉出来的(Scott and Snow 1978)。针的具体直径要根据实验的具体要求,大直径(lOOum) 的针比较容易挑取和转移孢子,然而在操作细胞密度比较高的区域是小直径(25um) 的针会比较合适,一般而言直径 SOjam 的针能满足大多数实验。在拉针时,将玻璃丝置于酒精喷灯的上方直到玻璃棒发热呈橘红色,将玻璃丝拉成合适直径的纤维,然后移出火焰。拉出的玻璃纤维切成约 2 cm 长的片段,并置于预先打湿的玻片上,然后用剃须刀片或玻璃盖玻片切成 lcm 的长度。理想的显微针应该有光滑平整的末端(图 23.1), 可以用显微镜观察直径和末端是否合适。 纤维针的玻璃支持棒是用直径 2 mm 玻璃制作的,100ul 玻璃毛细管正好适合。在距末端 lcm 处加热毛细管,当它变软时,向右弯成直角。在毛细管的末端滴一滴强力胶水,轻轻接触制作好的玻璃纤维,使玻璃纤维正好与毛细管支持棒的轴成直角,并且长度合适。显微针支持棒的长度应该适中,太短针头达不到平板表面。太长则容易扎入琼脂。当胶水干后,将显微针支持棒固定在显微操作平台上。 方法二:这种方法和第一种方法相同,区别在于不是自己制作针头,而是直接购买商品化的玻璃纤维。玻璃纤维剪成片段置于玻片上,然后用前面描述的方法制成末端光滑平整的显微针。和前面方法一样,显微针粘在支持棒上,然后固定在显微操作平台上。 |
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实验步骤 | 传统筛选合子的方法是将接合混合物涂布在选择平板上,二倍体细胞能生长,而单倍体细胞不能生长。合子的形态学特点使我们有可能从接合的单倍体细胞群体中将它识别出来,利用显微操作平台使我们很容易从未接合的细胞中分离合子。 如果单倍体细胞都是新鲜培养物,接合效果最好,一般从 30°C 培养 1~2 天的平板上收集的细胞接合的效果都较好。非新鲜培养的细胞包括在 4°C 放置几天的细胞也可以接合,但形成合子的时间会长于新鲜的培养物。 1.用无菌的牙签分别挑取等量的 MATa 和 MATa 细胞(大小为 1~2 mm) 于 YPD 平板上,彼此毗邻,然后将它们混匀,形成约直径 5 mm 的菌落。 2.在 30°C 培养平板 3 h。 3.用无菌牙签挑取接合混合物样品,在平板的表面画线。当平板用显微镜观察时,单个细胞就可以区分。 4.合子通过细胞间的融合,而单倍体细胞因为响应接合信息素而停止生长。合子会呈哑铃状,容易和大的出芽单倍体细胞混淆。中间出芽的合子会有独特的三叶形状,因而很容易从接合混合物中分辨出来。 5.用技术和方案 22 的方法,用显微针将合子分离至干净的区域。 6.在 30°C 培养平板 1~2 天。 7.为了确定分出的细胞的确是二倍体细胞,将它们影印在选择平板上。如果两种单倍体细胞没有明确的遗传标记,用接合测试法则(实验二)来确定细胞是否发生接合,正确的接合型是 MATa/MAL 二倍体。 |
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实验步骤 |
菌株的铺板效率是以培养基中可形成菌落的活力细胞的百分比衡量的(有时也称为克隆形成单位或 cfu)。测定铺板效率有以下两种简便的方法。 间接法1.测定培养物中的细胞密度,用 Coulter 计数仪测定培养物光密度或用血球计数板统计细胞个数。 2.确定要将细胞稀释至 103 个/ml 所需要的稀释系数。超声波处理细胞以便将菌块分散并按此稀释度将细胞稀释于蒸馏水中。 3.取 0.2 ml 稀释液涂布于 YPD 平板上,在所需温度下培养数天,计数菌落数目。将菌落数除以 200 即得到铺板效率,以小数表示(如 100 个克隆的铺板效率是 0.5)。 直接法1.取细胞密度为 106~107 个/ml 的培养物,超声波处理分散细胞。 2.涂布 0.2 ml 细胞悬液于 YPD 平板上,待液体干燥。 3.在所需温度下培养 16~24 h。 4.在四分体解剖显微镜下观察平板表面,有繁殖力的细胞将形成包含 50~100 个细胞的圆形微菌落,无繁殖力的细胞不会形成菌落但可形成由 1~10 个细胞组成的不规则集合。由此直接计算有繁殖力的细胞与无繁殖力的细胞数进而确定铺板效率。
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试剂、试剂盒 | |
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实验步骤 | 1.将单菌落接种于 3 ml 含有 100 ug/ml 氨节青霉素的 Terrific broth 培养基中,37°C 培养过夜。 2.取 1.5 ml 细胞悬液于微量离心管中,13000 r/min 离心 1min,弃去上清。 3.加入 100 ul 溶液 1[50 mmol/L 葡萄糖/10 mmol/LEDTA/25 mmol/L Tris(pH8.0)],用移液器吸头搅松菌块,使管底一侧的细胞脱落下来,用旋涡振荡器完全悬浮细胞。 4.加入 200ul 溶液 2(0.2mol/L NaOH/l%SDS),颠倒微量离心管 4 次混勻。冰浴 5 min。 5.加入 150ul 溶液 3(3mol/L 钾盐/5mol/L 乙酸盐),上下轻摇管子 4 次混匀。冰浴 5 min。 6.13000r/min 离心 5 min。 7.将上清倒人一个装有 500ul 苯酚的离心管中,旋涡振荡器充分混合,13000r/mm 离心 5 min。 8.取 300ul 上清移入一个洁净离心管,加入 750ul 100% 乙醇,振匀,室温放置 2 min。 9.13000r/min 离心 5 min 沉淀 DNA。倒去上清,倒扣于纸巾上约 5 min 排干液体。 10.以 50ul 溶液 4[TE (pH8.0)+10ug/ml RNase A] 悬浮 DNA 沉淀。 |
实验步骤 | |
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实验步骤 | |
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实验步骤 | 各种型号的显微操作平台所附带的显微针在四分体解剖、分离合子以及操作单个细胞都十分有用。显微针可以从商业公司购买。或者,将细的玻璃纤维粘在弯的玻璃毛细吸液管上,自己制作显微针,下面介绍两种方法: 方法一:显微针是用直径 2 mm 的玻璃丝在酒精喷灯上拉出来的(Scott and Snow 1978)。针的具体直径要根据实验的具体要求,大直径(100um) 的针比较容易挑取和转移孢子,然而在操作细胞密度比较高的区域是小直径(25um) 的针会比较合适,一般而言直径 50um 的针能满足大多数实验。在拉针时,将玻璃丝置于酒精喷灯的上方直到玻璃棒发热呈橘红色,将玻璃丝拉成合适直径的纤维,然后移出火焰。拉出的玻璃纤维切成约 2 cm 长的片段,并置于预先打湿的玻片上,然后用剃须刀片或玻璃盖玻片切成 1cm 的长度。理想的显微针应该有光滑平整的末端(图 23.1), 可以用显微镜观察直径和末端是否合适。 纤维针的玻璃支持棒是用直径 2 mm 玻璃制作的,100ul 玻璃毛细管正好适合。在距末端 lcm 处加热毛细管,当它变软时,向右弯成直角。在毛细管的末端滴一滴强力胶水,轻轻接触制作好的玻璃纤维,使玻璃纤维正好与毛细管支持棒的轴成直角,并且长度合适。显微针支持棒的长度应该适中,太短针头达不到平板表面。太长则容易扎入琼脂。当胶水干后,将显微针支持棒固定在显微操作平台上。 方法二:这种方法和第一种方法相同,区别在于不是自己制作针头,而是直接购买商品化的玻璃纤维。玻璃纤维剪成片段置于玻片上,然后用前面描述的方法制成末端光滑平整的显微针。和前面方法一样,显微针粘在支持棒上,然后固定在显微操作平台上。 |
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