一、固定的中期染色体细胞悬液的制备
(1)外周血样品
1.37℃水浴锅内预热RPMI-1640培养基、FCS、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素。
2.在二级细胞培养用超净台中,无菌条件下配制完全培μ基:100mL FCS、5mL L-谷氨酰胺、5mL青霉素/链霉素,加RPMI-1640至500ml。3.在2个Nunc培养管中,各加0.25mL外周血、5mL完全培养基、PHA(终浓度2%)。
4.37℃培养箱中孵育72h。
5.加10OpL15mg/mL的胸苷到每个培养物中,轻轻混匀。
6.37℃培养箱中孵育16〜18h。
7.180g离心5min。
8.弃上清,用5mL完全培养重悬细胞。
9.180g离心5min。
10.弃上清,用5mL完全培养重悬细胞团块。
11.37℃条件下孵育5h。
12.加100/×L10jLtg/mLKaryoMa×秋水酰胺。
13.37℃条件下孵育10min。
14.180g•离心5min。
15.弃上清,用37℃预热的7mL0.075mol/L KCl悬起细胞团块。
16.37℃条件下孵育15min。
17.180g离心5min。
18.弃上清。
19.将管子放在涡旋振荡器上以中速振荡,缓慢滴加预冷的甲醇:冰乙酸(3:1)固定液到细胞中。当细胞悬液变成褐色时,加速滴加固定液,至总体积5mL。
20.180g离心5min,弃上清。
21.加5mL预冷的固定液。
22.180g•离心5min,弃上清。
23.加5mL预冷的固定液。
24.180g离心5min,弃上清。
25.加3mL预冷的固定液重悬细胞。
26.储存在-20℃条件下备用。
(2)来自永生化淋巴细胞株
1.增殖细胞,直至全培基到50mL。.
2.收获细胞前的18〜24h,更换新鲜培养液。
3.收获时,将20mL生长良好的细胞移到50mL离心管中。
4.加200ΜL浓度为10μ×g/mL秋水酰胺,轻轻混匀。
5.37℃条件下孵育50〜60min。
6.180g离心5min。箱或水浴箱)。
5.预热Multiprobe®装置,探针面朝上(即突出表面朝上,标记表面朝下),不要接触突出方形块的表面。
6.准备一个染色缸装2×SSC,三个染色缸分别装70%、85%和100%的乙醇系列。
7.用2×SSC洗点好样的片子2min,然后依次在70%、85%和100%的乙醇中各脱水2min。
8.片子空气干燥后,有样品一面朝上的放在37℃加热板上。
9.同时,用10斗移液器取2,预热杂交液点到Multiprobe®装置上的突出方形块上(放置在37℃加热块上)。
10.小心翻转片子(点样品面朝下),使之与Multiprobe®装置上相应的方块接触,组装到Multiprobe®装置上;也就是方块1在Multiprobe®装置的最右上角。
11.小心地提起组装好的装置,翻转使片子在Multiprobe®装置的下面。
12.放在37℃加热板上10min。
13.将组装好的装置保持水平小心地转移到75℃加热板上。
14.变性1〜3min,变性时间取决于固定的染色体悬液时间长短。
15.立即转移组装好的装置到预热的ChromoprobeMultiprobe®杂交室(或者避光塑料玻片盒)中,更换盖子,然后在去盖的水浴锅中过夜。
二、
(4)杂交后洗脱和封片
1.将洗脱液I倒入干净的染色缸中,水浴中预温至72℃后,调整pH至7.0。
2.将洗脱液II倒入干净的染色缸中,室温(20〜25℃)放置。
3.从杂交室中取出组装好的Multiprobe®装置。
4.小心卸下Multiprobe®装置,立即将片子放在洗脱液I中2min,用镊子
夹住片子,轻轻的上下振荡。
5.转移到洗脱液II中30s。
6.夹住片子的长边,在纸上沥去过量液体10〜20s,但注意玻片表面不能干。
7.加20μL含DAPI的抗淬灭剂溶液到盖玻片(24mm×60mm,试剂盒中提供)的两端,轻轻地将片子上的杂交区域压到盖玻片上。
8.检查复染的区域,用钝头镊子轻轻按压排掉气泡。
9.将吸水纸盖在标本上方,轻轻按压以除去过量的液体。
10.将指甲油涂在盖玻片周围来封片。
11.观察前至少在黑盒或玻片夹中放置至少10min以备阅片。
(5)荧光显微镜下分析杂交后的片子
1.将标本放在显微镜载物台上。
2.使用10倍的物镜和DAPI滤光片观察第一方块,观察单个细胞的中期染色体。
3.加镜油到方形块,转换成100倍的油镜。
4.转换到三通滤光片(DAPI/FITC/德克萨斯红)观察中期染色体。
5.计数绿色短臂信号和长臂红色端粒信号,并记录染色体的位置。第一方块的正常实验结果是1号染色体上有两个绿色信号在短臂端粒区,两个红色信号在长臂端粒区。
6.分别用FITC滤光片或德克萨斯红滤光片确认实验结果。
7.重复步骤2〜6,直到该孔中不同的5个中期分裂相均得到明确的结果。
8.每个孔的检测都重复步骤2〜7。
9.记录分析结果,任何不正常的结果或者某些探针杂交结果不满意时,应该用这些探针重做杂交实验。
10.确认异常时采用患者的新鲜样本,可能的话同时分析父母样本,这样将有助于判定异常是否是真异常(如果为真异常的话,确定是原发的还是家族遗传的),还是良性多态变异的结果。
三、端粒克隆DNA的抽提
1.准备含特定抗生素50μg/mL氨苄青霉素、35μg/mL卡那霉素或12.5μg/mL氯霉素)的LB平板。
2.从-70℃取出甘油保存管,放在干冰上。
3.取甘油保存的菌种在LB平板划线后,37℃细菌培养箱培养过夜。
4.加100mL 2×YT培养基到500mL离心管中,按步骤1所示浓度加抗生素。
5.从平板上挑选单克隆接种到2×YT培养基,37℃摇床中培养过夜。
6.取700μL细菌培养物加300μL100%甘油混合均匀,分装在两个Eppendorf管中,标记好,-70℃条件下保存。
7.剩余的细菌培养物350g离心15min。
8.弃上清,将离心管倒扣在纸上沥干。
9.用30mL冷的细胞重悬液悬起沉淀,剧烈混匀和抽吸几次,使得小细胞团块彻底悬起10.加30mL细胞裂解液,上下轻轻颠倒一次。
11.室温放置5min(不要延长时间)。
12.立即加30mL冷的中和液,上下轻轻颠倒混匀。
13.冰上放置15min,每5min上下颠倒几次。
14.4℃下4000g•离心40min。
15.标记好一个新的250mL离心管,上面放一个塑料漏斗。
16.剪一个圆形的杂交网筛,中间剪开一个裂缝,装到漏斗上。
17.小心将离心的上清倒在网筛上,液体经过网筛和漏斗收集到250mL离心管里,注意不要有絮状物穿过网筛。
18.移去漏斗、网筛,用水、乙醇清洗以备下次使用。
19.加0.7倍体积的无水异丙醇沉淀DNA。
20.混合均匀,4000g离心10min。
21.弃上清,加入25mL70%乙醇。
22.振荡混匀,4000g离心10min。
23.弃上清,将离心管倒扣在纸上以去掉多余液体。
24.用1mL TE(pH8.0)重悬DNA沉淀。
25.取5μL抽提的DNA在0.9%的凝胶上电泳检测,用Xmnd III DNA作
为参考标准,完整的黏粒大小应该在大分子质量的位置。
26.测量抽提的DNA浓度(如使用荧光光度计)。
27.在-20℃储存抽提的DNA。
四、用缺口平移法间接标记端粒克隆DNA
1.将Eppendorf管放在冰上,然后加入1.0μg待标记DNA、1.2μL生物素-16-dUTP(如果标记短臂探针)或地高辛-11-dUTP(如标记长臂探针)等,加蒸馏水至总体积50μL。
2.轻轻振荡,稍离心以去气泡。
3.在15℃水浴中反应90min。
4.将反应体系放在冰上暂停反应。
5.取5μL在2%的琼脂糖凝胶上检测片段大小,用Phi×174作为DNA大小的参考标准。
6.最适于杂交的片段大小为50〜500bp条带。如果片段大于500bp,则补加1.0μL DNase I,15℃孵育30min
7.当探针大小合适时,用装有交联葡聚糖G50的SELECT-B离心柱过柱去掉未结合的核苷酸。
8.加25μL鲑鱼精DNA(若标记的探针超过1哗,则按比例增加鲑鱼精DNA。
9.加蒸馏水调整探针浓度为10ng/μL(应扣除已用于检测的探针量)。
10.记录10ng/μL探针混合物的体积。
11.每微升探针混合物加入适量的人Cot-1DNA[加入量依据探针和原始插入的片段大小而定。
12.计算好含120ng探针的人Cot-1DNA/探针混合物的体积,按体积取出移到新的Eppendorf管中。
13.在真空离心机中离心干燥Cot-1DNA/探针混合物(注意不要过于干燥)。
14.为了获得某染色体长短臂端粒特异性探针杂交液混合物,将Cot-1DNA/长臂或短臂探针混合物分别重悬在38μL杂交液中,两者合并成76μL杂交液。
15.若制备单独检测长臂或短臂端粒的探针,则将Cot-1DNA/探针混合物直接重悬在76uL杂交液中。
16.混匀后在-20℃条件下储存。
五、间接标记探针的杂交和杂交后处理
(1)杂交
1.打开加热板,调整温度到75℃并预热。
2.取18斗探针杂交液到Eppendorf管,并预热到37℃(水浴锅或加热
板)。
3.按照3.2.1中所示方法调整细胞悬液至最佳浓度。
4.将高质量显微载玻片浸泡在无水甲醇中2min。
5.用干净的软纸擦干片子。
6.将10〜20;×L调整好浓度的细胞悬液滴加到载玻片的中央。
7.将标本放置干燥,用相差显微镜的1〇倍物镜检查标本的质量。
8.在磨砂处标记实验内容,用钻石笔在载玻片背面划定样品区域。
9.准备一个染色缸装2×SSC,三个染色缸依次装70%、85%和100%的乙醇。
10.将制备好的片子(用固定的细胞悬液点样)用2×SSC洗2min,然后依次在70%、85%和100%的乙醇中各脱水2min。
11.片子空气干燥后,有样品一面朝上放在37℃加热板上12.轻轻上下抽吸混匀预热的杂交液,小心不要产生气泡。
13.吸取杂交液加到钻石笔划定区域的中央。
14.小心地将一个22mm×22mm盖玻片盖到杂交液,用钝头镊子轻轻按压排掉气泡。
15.小心地将片子(盖玻片一面朝上)放在75℃加热板上。
16.变性、1〜3min,变性时间取决于细胞悬液的老化程度
17.变性后立即转移到预热的避光塑料玻片盒中,37℃水浴中杂交过夜(水浴锅不盖盖子)。
(2)杂交后洗脱、抗体检测和复染
1.准备封闭液和抗体溶液1〜3。
2.振荡抗体溶液,在微型离心机中以最大转速离心10min。避光放置,如有必要可在室温中预温。
3.加洗脱液I到干净的染色缸中,水浴中预温到72℃后调整pH至7.0。
4.加洗脱液II到干净的染色缸中,室温(20〜25℃)放置。
5.同时将用水湿润的吸水纸放在一个空的避光塑料玻片盒(如空的玻片盒)的底部。
6.用剪刀为每个标本准备4张大小约为22mm×64mm的封口膜。
7.从避光塑料盒中取出标本,在纸上快速去掉盖玻片。
8.立即将片子放在洗脱液I中2min,用镊子夹住片子,轻轻的上下振荡。
9.转移到洗脱液n中30s。
10.夹住片子的长边,在纸上沥去过量液体10〜20s,注意不要使片子表面过于干燥。
11.将片子架到预先准备好的避光塑料玻片盒子中(如玻片两端搭在玻璃棒上或盒子底部平台上),取300μL封闭液加到片子上,用封口膜覆盖,避免产生气泡。
12.盖上玻片盒盖子,37℃温箱中孵育40〜50min。
13.37℃预热1.5LST缓冲液。•
14.孵育完成后去掉封口膜,将片子放在标本架上浸泡在预热的ST缓冲液中。
15.放在摇床平台上振荡3min,将倒置的避光容器放在上面保持暗环境。
16.按步骤10所示方法沥去标本上的过量液体。
17.将片子放到避光塑料玻片盒中架子上,取80μL抗体溶液1加到杂交区域。
18.用封口膜覆盖,避免产生气泡
19.盖上盖子,37℃温箱中孵育10min。
20.去掉封口膜,将片子放在标本架上浸泡在预热的ST缓冲液。
21.放在摇床平台上避光振荡3min。•
22.倒掉原来的ST缓冲液,更换新的预热ST缓冲液。
23.重复2次步骤21和22。
24.洗完3次后,按步骤10所示方法沥去过量液体。
25.将片子放到塑料避光容器中架子上,取5OμL抗体溶液2加到杂交区域。
26.用封口膜覆盖,避免产生气泡。
27.盖上盖子,37℃温箱中孵育10min。
28.去掉封口膜,在热的新ST缓冲液中洗3次,每次3min。
29.将片子按步骤10所示沥去过量液体。
30.将片子放到塑料避光容器中架子上,取80μL抗体溶液3加到杂交区域。
31.盖上盖子,37℃温箱中孵育10min。
32.去掉封口膜,在热的新ST缓冲液洗3次,每次3min。
33.在最后ST缓冲液洗脱过程中,加大约25μLDAPI复染液到放在纸上的22mm×22mm盖玻片上。
34.将片子按步骤10所示沥去过量液体。
35.轻轻地将片子的杂交区域倒扣到加有DAPI复染液的盖玻片上。
36.将吸水纸盖在标本上方,轻轻按压以除去过量的复染液。
37.检查复染的区域,用钝头镊子轻轻按压排掉气泡。
38.将指甲油涂在盖玻片周围来封片。
39.按二、(5)中所示方法避光放置至干燥后用荧光显微镜观察。
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